LCM、IMB聯合MALDI-TOF-MS技術在惡性卵巢上皮瘤相關標志物分離檢測中的應用

周 怡,王 琪,張 瑋,李 力,＊

(1廣西醫科大學醫學科學實驗中心,南寧 530021;2廣西醫科大學附屬腫瘤醫院)

激光捕獲纖維切割(LCM)技術可以根據形態學標準直觀、準確和高效地從復合組織中特異性挑選出某一特定類型的細胞[1]。免疫磁珠(IMB)技術能使與磁珠上抗體特異性結合的抗原從其他物質中分離出來,在免疫檢測、細胞分離、蛋白質純化等方面均顯示出良好的應用前景[2]。本研究采用 LCM聯合IMB技術釣取惡性卵巢上皮瘤細胞中的特異性標志物黑色素瘤激活因子CXCL1及IL-8(1～77 aa)、IL-8(6～77 aa)和IL-8(9～77 aa),并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)技術進行了檢測。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 正常、良性及惡性卵巢上皮瘤組織為 2006～2008年廣西醫科大學附屬腫瘤醫院留取的手術標本,經術后病理檢查證實。惡性卵巢上皮瘤按照FIGO標準診斷為卵巢上皮癌,組織分級為 G2級,臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期。

1.1.2 主要儀器及試劑 快速冰凍切片機,激光捕獲微切割顯微鏡,基質輔助激光解吸時間飛行質譜。IMB試劑盒,微量層析柱,CXCL1、IL-8抗體。TBO染液,動物細胞裂解液等。

1.2 方法

1.2.1 細胞捕獲及其蛋白的提取 正常、良性及惡性卵巢上皮瘤組織冰凍切片的制備、染色及脫水過程如文獻[3]所述。采用 LCM技術,每張切片平均捕獲8 000 shottings。收集捕獲細胞,-80℃保存。用動物細胞裂解液試劑盒提取捕獲細胞的總蛋白,按說明書操作。

1.2.2 CXCL1及不同亞型IL-8分離 采用IMB技術。操作按說明書進行。

1.2.3 CXCL1及不同亞型IL-8蛋白樣本的濃縮和脫鹽 采用含C18填料的微量層析柱對CXCL1及不同亞型IL-8蛋白樣本進行濃縮和脫鹽。

1.2.4 CXCL1及不同亞型IL-8的檢測 上述蛋白樣品酶切消化成肽段后,多肽的串聯質譜鑒定用MALDI-TOF-MS技術進行。

2 結果

捕獲正常、良性及惡性卵巢上皮瘤細胞數分別為 1.32×106、1.40×106、1.28×106個。

M/Z為7 860的CXCL1在惡性卵巢上皮瘤細胞中表達,且表達豐度較高(縱軸指示intense＞104),在良性卵巢瘤和正常卵巢上皮細胞中均不表達。

M/Z約為8 930的IL-8(1～77 aa)在惡性和良性卵巢瘤細胞中表達,在正常卵巢細胞中不表達; M/Z約為8 360的IL-8(6～77 aa)在惡性卵巢腫瘤細胞中表達,在良性和正常樣本中不表達;M/Z約為8 130的IL-8(9～77 aa)在卵巢惡性瘤細胞及良性或正常卵巢細胞中均不表達。另外,在經 IL-8 IMB獲取的卵巢上皮癌樣本中也發現 M/Z約為7 860的CXCL1,可能與CXCL1和其他CXC族趨化因子如IL-8、NAP-2、ENA-78、PF-4等具有較高同源性有關。

3 討論

本課題組先期采用表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)分析比較卵巢惡性腫瘤與正常婦女外周血中的蛋白質譜表達差異,并構建診斷模型,篩選確定對早期診斷卵巢癌有價值的外周血蛋白質質譜,結果發現 M/Z為 7 869、8 136、8 386和 8 927的蛋白對卵巢癌早期診斷具有重要意義。采用HPLC液相系統和質譜技術對上述蛋白質予以純化鑒定,發現它們分別為黑色素瘤激活因子CXCL1和IL-8的不同亞型,即IL-8(1～77 aa)、IL-8 (6～77 aa)和IL-8(9～77 aa)[4]。之后,我們采用雙抗夾心ELASA法,應用商業化的CXCL1和IL-8抗體,檢測其在 59例卵巢惡性腫瘤患者、64例卵巢良性腫瘤患者、142例健康婦女血清中的含量,結果顯示,CXCL1和IL-8在卵巢惡性腫瘤患者血清中的平均含量極顯著高于非惡性腫瘤人群(P＜0.01)。

Yang等[5]的研究認為,CXCL1可被致癌基因Ras誘導產生,CXCL1依賴p53途徑誘導基質纖維原細胞凋亡,而基質纖維原細胞衰亡促進腫瘤生長,是正常卵巢上皮細胞轉變為惡性腫瘤細胞的必要途徑。Dannenmann等[6]也在卵巢癌組織和快速增殖的卵巢癌細胞株中檢測到 CXCL1,進一步證實CXCL1可促進卵巢癌細胞增殖。

由于蛋白質水解酶剪接IL-8的N末端編碼氨基酸序列位置不同,形成 6種氨基酸序列長度不同的IL-8亞型,其多肽序列分別為第 1～77、第5～77、第 6～77、第 7～77、第8～77、第 9～77氨基酸殘基,這些亞型都具有生物學活性,但不同亞型的 IL-8誘導中性粒細胞的趨化和脫顆粒的能力是不同的[7]。采用質譜技術則可以發現不同亞型IL-8在卵巢癌細胞或血清等中的差異。

本研究采用LCM、IMB聯合MALDI-TOF-MS技術,有效地獲取了卵巢上皮癌細胞的特異標志物CXCL1及不同亞型IL-8,并準確地對其進行區分。我們將繼續深入研究CXCL1、不同亞型IL-8的定位及其在卵巢組織上皮細胞中的相對表達量,并進一步探討其在卵巢惡性腫瘤早期診斷中的價值。

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