豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進展

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豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進展

遲 蘭 汪鵬旭 丁文衛（徐州生物工程職業技術學院 江蘇徐州 221006）

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的接觸性傳染病，主要引起懷孕母豬后期流產、早產、死胎和木乃伊胎增多，仔豬出現呼吸道癥狀和斷奶前死亡率增高。該病最早于1987年發生于美國的北卡羅納、衣阿華等州，隨后在短短的幾年時間內，迅速遍及全球各養豬業發達的國家和地區(北美洲，1987；歐洲，1990；亞洲，1991)。1991年，荷蘭科學家Wensvoort 博士首次從感染豬體內分離到該病毒，并命名為Lelystad病毒(LV)，1992年美國研究人員用CL2621細胞也分離到PRRSV，并命名為VR-2332毒株[1]。雖然世界各地所分離的PRRSV可引起類似的癥狀，但根據資料顯示，PRRSV在毒力性、抗原性以及遺傳性方面均有很大的差異，根據基因序列以及抗原性差異，將PRRSV分為A、B兩個亞群。A亞群即以LV為代表的歐洲型毒株，B亞群即以VR-2332株為代表的美洲型毒株。二者的基因組核苷酸一致性僅55%~70%，但其形態結構、復制特點、細胞嗜性、流行傳播方式及其引發的疾病特征等生物學特性均相同。目前亞洲的日本、韓國、菲律賓等國也有該病報道。1995年國內某些豬場發生流產、死胎等繁殖疾病，1996年哈爾濱獸醫研究所在國內首次分離到PRRSV，證實本病在國內存在[2]。

1 PRRSV的一般特性

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)為不分節段、聚腺苷酸化、有囊膜的正鏈單股RNA病毒，屬于尼多病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。成熟的病毒粒子直徑約50~72nm，核衣殼直徑約20~30nm，呈20面體對稱。在蔗糖中的浮密度為1.13~1.15g/ml，在氯化銫中的浮密度為1.18~1.19g/ml，本病毒不能凝集豬、羊、牛、鼠、馬、鴨、雞以及人O型紅細胞。PRRSV對溫度敏感，-20℃以下可長期保存，4℃以上保存一周后感染性喪失90%，但30d后仍可檢出有感染性的病毒粒子。將PRRSV陽性血清保存于25℃環境中，24h后病毒分離率為47%，48h后分離率下降到14%，而72h后分離率僅為7%，因此，在進行病毒分離時，病料必須在低溫下保存和運輸。PRRSV對pH值敏感，在pH低于6.0或高于7.5時，很快喪失活力。病毒粒子對乙醚、氯仿等脂溶劑也非常敏感[3]。囊膜破壞后，其核心粒子無感染性。

2 PRRSV的分子生物學特性

2.1 PRRSV的復制特性 PRRSV基因組全長約15kb，有8個開放性閱讀框架(ORFs)，基因組5’端有一段非編碼區5’NCR序列，隨后是復制酶基因ORF1a、ORF1b和結構蛋白基因ORF2-7、以及3’非編碼區和Poly(A)結構。其中ORF1a、1b占整個基因組的75%以上。大多數ORF之間形成長短不一的部分重疊。PRRSV基因組RNA通過不連續的轉錄機制產生一系列的亞基因組mRNA，這些亞基因組mRNA的5’端都具有一個來自于基因組RNA 5’NCR的共同的前導序列，并且形成一個共3’端的嵌套式結構，這也正是尼多病毒目的特征。

2.2 病毒基因組編碼的蛋白質 PRRSV基因組編碼的蛋白有復制酶、聚合蛋白和結構蛋白。ORF1編碼復制酶和聚合蛋白，是唯一的非結構蛋白，參與病毒的復制。ORF1a編碼的聚合蛋白經裂解后產生6個非結構蛋白(NSP1α，NSP1β和NSP2~5)。其中NSP2的氨基酸序列在美洲株和歐洲株之間的同源性僅有32%，實驗表明NSP2基因中含有B細胞表位免疫的優勢基因；NSP1α和NSP1β包含兩個類木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶區。ORF1b編碼的聚合蛋白長約1463個氨基酸，被ORF1a編碼的蛋白酶切割后形成RdRp、CP2、CP3、CP4個蛋白。

GP2為結構糖蛋白，由ORF2編碼，分子量為29~30kDa，有兩個明顯的疏水峰和糖基化位點，LV的GP2能整合入病毒粒子中。GP2肽鏈內含有二硫鍵，通過二硫鍵可和其他結構蛋白形成同源或異源多聚體，其糖基化位點被N-聚糖復合物覆蓋。GP2蛋白表面有一個抗原位點，其周圍有一個VSRRIYQ基元，可與GP5蛋白B細胞抗原位點構成二級結構。GP2蛋白免疫原性很差，在病毒中含量較少，很難從感染的細胞裂解液或純化的病毒粒子中得到分離鑒定。

GP3為高度糖基化蛋白，具有7個糖基化位點，分子量為40~50kDa，含265個氨基酸。現在對GP3是否為結構蛋白尚無定論。GP3蛋白羧基端有一個與病毒血清型有關的非中和抗原表位，其可能引起病毒基因型抗原性的差異。GP3是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一，在歐、美型毒株間推導氨基酸的同源率為54%~60%，而且多數變異發生在N末端。Duran等人用桿狀病毒表達載體表達了PRRSV ORF3的產物，表達產物可給豬提供68.4%的保護率，說明ORF3表達產物在抵抗病毒感染時具有一定作用。

GP4蛋白是病毒的主要結構蛋白之一，分子量約為31~35kDa，有4個糖基化位點，其N端和C端有高度的疏水區。該蛋白氨基端有一信號肽序列，在GP4蛋白胞外區第40~79位氨基酸之間有一個可與單抗發生中和反應的抗原決定簇，該區域在不同的PRRSV中高度可變，它可能與免疫選擇有關。

GP5為糖基化的囊膜蛋白，又稱E蛋白，分子量約為26~30kDa，含4個糖基化位點和一段31個氨基酸的信號肽，該蛋白含有一段很大的內部疏水區。E蛋白與M蛋白在囊膜內由二硫鍵結合成異源二聚復合物，其內含有與病毒有關的免疫重要區。GP5有6個抗原決定簇，能誘導機體產生特異性中和抗體，另有報道，GP5可誘導并引發細胞凋亡。

ORF6編碼非糖基化蛋白，也稱M蛋白，分子量為18~19kDa。VR-2332型和LV型分別含有174和173個氨基酸。M蛋白的N端有3個疏水性跨膜區，針對該蛋白的單抗從歐洲和北美洲的分離株中識別出2個共同和1個獨特的抗原決定簇。M蛋白在所有的PRRSV株間高度保守，在歐、美型毒株間也最為保守。通過感染豬康復血清的Western免疫印跡試驗證明了M蛋白具有很強的免疫性，感染后10d就可以檢測該抗體應答。表達重組的M蛋白可作為血清學實驗的靶抗原。

ORF7編碼核衣殼(N)蛋白，分子量為13.8~15kDa，堿性，親水性，具有一個糖基化位點，但非糖基化蛋白。北美洲型和歐洲型分離株分別含有123個和128個氨基酸。N蛋白有6個疏水區及至少5個抗原決定簇，其中既有對所有毒株保守的共同決定簇，又有北美洲各型和歐洲各型的特異性決定簇。N蛋白在病毒粒子中含量較高，約占病毒蛋白總量的20%~40%，具有較高的免疫原性。通過Western-blot證明豬感染PRRSV后最早出現(大約7d)的是針對N蛋白的抗體，且該抗體可持續存在半年以上，因此N蛋白可作為PRRSV抗體的檢測抗原，無論早期還是晚期都有重要的診斷學意義；但此抗體為非中和抗體，對機體無保護作用，無免疫學價值[4]。

3 PRRSV的遺傳變異

PRRSV各毒株之間，尤其是歐洲分離株與北美分離株之間存在很大的差異。盡管不同PRRSV分離株引起同一疾病，但用多克隆抗血清或單克隆抗體進行的血清學試驗證實毒株之間存在顯著的抗原多樣性，這可能是由于結構蛋白氨基酸出現廣泛變異所致。

北美洲型毒株之間也存在廣泛的差異。Andreyev等分析了分離自美國、加拿大和危地馬拉的22株PRRSV ORF5序列，它們與VR-2332 ORF5編碼氨基酸的同一性在89%~94%之間，其中還有兩株只有2個(大多數是3個)糖基化位點。因此，有人將北美洲型進一步劃分為3個亞型。

Yoon等用5種針對核衣殼蛋白的單抗評價了1989~1993年間分離自美國22株分離物之間的抗原關系，根據其反應性不同而將其劃分為3群。Yang等曾經用23種單抗將美國1989~1995年間分離的70株病毒分為5群，抗原變異歸因于群特異性的單堿基置換，LV迥異于北美洲分離株而成為一個獨特的抗原群。Drew等用6種針對核衣殼蛋白的單抗對25株歐洲分離株間的抗原關系進行了比較，發現歐洲毒株也存在抗原變異。

對基因組的基因序列分析比較從分子遺傳學上闡釋了血清學試驗所證實的抗原多樣性[4]。ORF7是極為保守的病毒基因，北美洲毒株間ORF7氨基酸同一性高達95%~100%，而與歐洲型毒株間ORF7氨基酸同一性只有57%~59%；ORF6是北美洲毒株與歐洲型毒株間最為保守的病毒基因，氨基酸同一性可達70%~81%；ORF2-4氨基酸同一性分別為91%~99%、86%~98%和92%~99%[5]。這些證據表明，PRRSV分離株可區分成兩種不同的基因型，即歐洲型(代表毒株為LV)和北美洲型(代表毒株為VR-2332)。歐洲地區主要流行歐洲型，而美洲和亞太地區則以后者為主要毒型。

不同分離株對不同階段的妊娠母豬的致病性差別很大，這表明各毒株在毒力上有所不同。有的豬群已發生PRRS血清學陽轉，卻沒有明顯的繁殖障礙，這可能是由于該毒株對生殖系統的毒力已經減弱造成的。隨著病毒與宿主和環境的相互作用而具有不同的毒力特征，這有助于解釋現地常見的亞臨床感染現象。

4 中國PRRSV分子生物學研究

4.1 分子克隆 蔡家利等[6]克隆了PRRSV美國弱毒疫苗株PRMV株ORF6和ORF7，并進行了序列測定和比較。仇華吉等[7]克隆了CH-1a株的全部結構蛋白基(ORF2-ORF7)。研究表明，主要免疫原性基因ORF3和ORF5的體外表達產物可誘導保護性免疫，因此ORF3和ORF5的分子克隆為下一步構建重組疫苗或者基因疫苗奠定了基礎。ORF7編碼的保守性核衣殼蛋白是PRRSV的重要結構蛋白，它是現代血清學試驗的抗原基礎，具有診斷學意義，克隆ORF7是研制重組抗原的必要前提。

4.2 序列測定與分析 姜平等[8]擴增了華東和華北分離株的ORF5、ORF6和ORF7，并測定了序列，與VR-2332株核苷酸同一性均為99%，同源性如此之高是PRRSV罕見的。姜平等對華東和華北分離株ORF5-7也進行了序列分析。仇華吉等測定了CH-1a株ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7的核酸序列，并與國外參考毒株序列進行了比較分析。CH-1a株ORF2與美洲型標準毒株VR-2332株和歐洲型株毒株LV株核苷酸同一性分別為95.3%和64.2%，氨基酸的同源性為95.3%和62.9%；CH-1a株ORF3與VR-2332株還有LV株核苷酸同一性為91.5%和65.3%，氨基酸的同源性分別為88.6%和61.9% ；ORF4與VR-2332株還有LV株核苷酸同一性91.6%和63.5%，氨基酸的同源性分別為92.1%和70.5%；ORF5與VR-2332株還有LV株核苷酸同一性為92%和65.4%，氨基酸的同源性分別為93%和61%；ORF6與VR-2332株還有LV株核苷酸同一性為94.9%和70.2%，氨基酸的同源性分別為97%和81%；ORF7與VR-2332株、IAF-exp01株(加拿大參考毒株)和LV株核苷酸同一性為94.6%、93%和66.1%，氨基酸的同源性分別為97.6%、97%和68.8%。根據ORF5和ORF7繪制的系統發育進化樹表明CH-1a株與VR-2332株可能來源于同一祖先。利用有關軟件分析了ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7編碼產物的等電點、糖基化位點、疏水性、抗原性和有關位點，積累了PRRSV分子生物學和分子流行病學資料。

4.3 體外表達 仇華吉等利用原核表達系統高校表達了CH-1a株ORF7，表達產物具有特異性免疫活性，為重組診斷抗原的生產奠定了基礎。ORF5的真核表達質粒和ORF7的桿狀病毒載體也已經構建成功，表達蛋白的研制和應用正在進行中。

[1] Collins JE, Benfield DA, Vhristianson WT, et al. Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of disease in gnotobiotic pigs. J. Vet. Diagn. Invest.1992, 4:117-126.

[2] Allende R, Lewis TL, Lu Z, et al. North American and European porcine reproductive and 1999, 80:307-315.

[3] Jusa ER, Inaba Y, Kohno M, et al. Hemagglutination with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Vet. Med. Sci. 1996, 58:521-527.

[4] Drew TW,Meulenberg JJM,Sands JJ,et al.Production,characterization and reactivity of monoclonal antibodies to procine reproductive and respiratory syndrome virus.J Gen Virol 1995,76:p1361-1369

[5] Meng XJ ,Paul PS,Halbur PG,et al.Phylogenetic analyses of the putative M(ORF6) and N(ORF7) genes of procine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV):implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe.Arch Virol,1995b,140: 745-755.

[6] 蔡家利,姜平,蔡寶祥,馬志勇. 豬繁殖和呼吸綜合征病毒基質膜蛋白和核衣殼蛋白基因的克隆與鑒定. [J]中國獸醫學報, 1999(1).

[7] 仇華吉, 郭寶清, 童光志等.豬繁殖-呼吸綜合征病毒CH-Ia株基因型鑒定[J]. 中國獸醫學報.1998, 18(2): 118-121.

[8] 姜平, 陳溥言, 蔡寶祥. 豬繁殖和呼吸綜合征病毒分子生物學研究進展[J]. 中國獸醫雜志, 1998(12).

S858.28

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1007-1733(2011)01-0064-03

（2010–11–21）