微波制備IFN－γ處理的小鼠H22肝細(xì)胞疫苗免疫對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響

楊曉峰，楊新宏，朱艷菊，丁曉旭，李曉明，孫立新

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一個(gè)最重要系統(tǒng)，廣泛參與免疫應(yīng)答、免疫效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞的功能是衡量機(jī)體免疫水平的一項(xiàng)重要標(biāo)志，為機(jī)體免疫清除突變細(xì)胞的重要因素。2007年9月，我們根據(jù)IFN－γ可促進(jìn)MHC－I類(lèi)抗原表達(dá)，微波修復(fù)抗原可提高病理組織的抗原性原理，應(yīng)用IFN－γ和微波制備全細(xì)胞瘤苗，觀察了此瘤苗對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/C小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量14～16 g，8周齡，正常飼養(yǎng)。肝癌細(xì)胞H22瘤株:由白求恩醫(yī)科大學(xué)提供，液氮凍存。使用時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞，接種于含10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ，接種于BALB/C小鼠腹腔傳代。

1.2 H22肝癌細(xì)胞疫苗(MITTV－H22)及 H22細(xì)胞抗原的制備 ①M(fèi)ITTV－H22制備。收集 BALB/C小鼠腹水H22腫瘤細(xì)胞，1640培養(yǎng)液洗2遍，常規(guī)培養(yǎng)，并加入 IFN－γ(200 U/ml)，培養(yǎng) 48 h［1］。收集H22細(xì)胞，生理鹽水洗2遍，制成2.5×106/ml的細(xì)胞懸液，微波照射20 s(750 W、2450兆赫)，制成MITTV－H22，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＝?jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色鏡下觀察證實(shí)腫瘤細(xì)胞已全部滅活。②H22細(xì)胞抗原制備。收集H22細(xì)胞，生理鹽水洗2遍，調(diào)至1×107/ml，將細(xì)胞懸液置－80℃冷凍，37℃水浴溶解，反復(fù)凍融4次。13 000 r/min、離心60min，吸取上清，過(guò)濾除菌，分裝，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型制備 小鼠檢疫10 d后隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)組右后肢外側(cè)皮下接種MITTVH22懸液0.2 ml，每周免疫1次，共3次;對(duì)照組用生理鹽水代替MITTV－H22。末次免疫后第7天處死小鼠，腹腔內(nèi)注入預(yù)冷的Hank's液5 ml/只，輕輕按揉腹部，以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞;將腹壁剪開(kāi)一個(gè)小口，吸取腹腔灌洗液收集腹腔巨噬細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。各組在同等條件下飼養(yǎng)，均自由飲食。

1.4 巨噬細(xì)胞表面分子MHC－Ⅱ表達(dá)水平測(cè)定［2］腹腔巨噬細(xì)胞與H22抗原(1∶10)37℃、5%CO2共培養(yǎng)18 h。收集巨噬細(xì)胞PBS洗3次后棄上清，加入MHC－Ⅱ熒光抗體，4℃暗室孵育30min，加入PBS 500 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.5 吞噬率計(jì)算 吸取0.5 ml含0.5%雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞懸液，加入玻片上，37℃孵育15～20min。迅速用生理鹽水沖掉未貼壁細(xì)胞，吉姆薩染色，鏡下計(jì)數(shù)吞噬率。吞噬率(%)=(吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6 細(xì)胞周期測(cè)定 將腹腔巨噬細(xì)胞與H22抗原(1∶10)37℃、5%CO2共培養(yǎng)18 h。同時(shí)常規(guī)制備MITTV－H22免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，與巨噬細(xì)胞(經(jīng)H22抗原處理18 h)共孵育(24孔板，脾淋巴細(xì)胞1×107/孔，巨噬細(xì)胞1×104/孔)24 h。收集懸浮的脾淋巴細(xì)胞，PBS洗3遍，棄上清，調(diào)為1×107/ml細(xì)胞懸液，取 100 μl加入 Hamster anti mouse CD69－PE抗體，室溫避光30min，加入500 μl PBS混勻，F(xiàn)ACS檢測(cè)脾細(xì)胞表面抗原CD69分子。同時(shí)另取脾淋巴細(xì)胞懸液［3，4］，PBS 洗 3 遍，75%乙醇固定過(guò)夜。PBS洗 3次，棄上清，剩余 50 μl細(xì)胞懸液，加入RNase A(1 mg/ml)100 μl，37 ℃ 孵育 30min，加入PI(0.5 mg/ml)50 μl，PBS 800 μl，室溫避光 30min，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔巨噬細(xì)胞表面分子MHC－Ⅱ表達(dá)率 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組巨噬細(xì)胞表面分子MHC－Ⅱ的表達(dá)率分別為 85.95% ± 1.50%、62.71% ± 1.86%，P=0.000(t=30.808)。

2.2 巨噬細(xì)胞吞噬率 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組巨噬細(xì)胞吞噬率分別為 35.30% ±9.79%、15.00% ±6.63%，P=0.000(t=5.429)。

2.3 脾淋巴細(xì)胞表面CD69表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞表面 CD69表達(dá)率分別為11.96% ±4.20%、5.94% ±1.41%，P=0.016(t=3.038)。

2.4 細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組S+G2－M期脾淋巴細(xì)胞所占比例分別為51.17% ±3.11%、31.56%±2.59%，P=0.000(t=9.684)。

3 討論

MHC－Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)于所有有核細(xì)胞，而腫瘤往往表達(dá)明顯減少或丟失，不能引起有效的殺腫瘤效應(yīng)［5］，從而逃避宿主的免疫攻擊。腫瘤細(xì)胞表面“抗原覆蓋”或“抗原遮蔽”是腫瘤細(xì)胞逃避免疫攻擊的另一因素。抗原覆蓋是指腫瘤細(xì)胞表面抗原可能被某些物質(zhì)所覆蓋，如腫瘤細(xì)胞可表達(dá)高水平的唾液黏多糖或表達(dá)腫瘤激活的凝聚系統(tǒng)，均可覆蓋腫瘤抗原。腫瘤抗原可經(jīng)糖基化等方式隱藏，這一過(guò)程稱(chēng)為抗原遮蔽。可致腫瘤抗原不能被宿主的淋巴細(xì)胞所識(shí)別，不能有效地被殺傷。IFN是調(diào)節(jié)MHC－Ⅰ類(lèi)抗原表達(dá)的一個(gè)重要生物因子［6］。IFN－1、IFN－2均可引起MHC－Ⅰ類(lèi)抗原表達(dá)增高，但I(xiàn)FN－γ的作用更強(qiáng)。微波作為抗原修復(fù)的方法已廣泛用于免疫組織化學(xué)染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修復(fù)方法，其可使病理切片的抗原更充分暴露，提高免疫組化染色的敏感性。小鼠H22肝癌細(xì)胞株腫瘤抗原性弱，MHC－Ⅰ表達(dá)缺失。基于IFN－γ的上調(diào)MHC－Ⅰ和微波暴露抗原的原理，我們用IFN－γ和微波共同處理H22腫瘤細(xì)胞，制備MITTV－H22瘤苗，既消滅了其致瘤性又增加了其表面MHC－Ⅰ及抗原的表達(dá)，可提高其抗原呈遞能力和抗原性。

在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞由于其活躍的生物學(xué)功能，尤其是在免疫應(yīng)答和機(jī)體防御機(jī)制中的作用而一直受到重視，是腫瘤生物學(xué)療法中的重要應(yīng)答和調(diào)動(dòng)環(huán)節(jié)之一［7］，其擔(dān)負(fù)著吞噬細(xì)菌、提呈抗原、啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答、抗腫瘤并參與免疫調(diào)節(jié)等作用［8］。巨噬細(xì)胞直接吞噬腫瘤細(xì)胞，顯示出非特異性殺瘤作用，同時(shí)巨噬細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，將攝入的腫瘤細(xì)胞消化、加工，并將特異性抗原以MHC限制的形式遞呈給T淋巴細(xì)胞，從而參與特異性腫瘤免疫［9，10］。巨噬細(xì)胞的吞噬功能有利于其清除腫瘤，亦是其加工處理抗原的前提。本研究結(jié)果顯示，MITTV－H22瘤苗免疫小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng)，有利于巨噬細(xì)胞功能的發(fā)揮。巨噬細(xì)胞表面MHC－Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)是抗原提呈的分子基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)MITTV－H22瘤苗免疫小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MHC－Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)增強(qiáng)，有利于其抗原提呈功能的發(fā)揮。因巨噬細(xì)胞活化淋巴細(xì)胞的能力是其抗原提呈功能實(shí)現(xiàn)的具體表現(xiàn)，故淋巴細(xì)胞增殖表達(dá)的CD69等活化分子，可以作為淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)志。

T細(xì)胞活化后表達(dá)數(shù)個(gè)膜表面分子，包括CD69、IL－2受體CD25、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71，被稱(chēng)為活化標(biāo)志。CD69是其中表達(dá)最早的一個(gè)，刺激后1～2 h即可在T細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)并迅速達(dá)到高峰，表達(dá)可持續(xù)72 h［11］。靜止?fàn)顟B(tài)的T細(xì)胞不表達(dá)CD69，但當(dāng)T細(xì)胞受刺激活化后可誘導(dǎo)性表達(dá)CD69。T細(xì)胞表面CD69與其單克隆抗體結(jié)合可引發(fā)細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi) TNF、IFN－γ 等細(xì)胞因子分泌，IL－2 及其受體合成與表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子AP－1的活性，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖;因此其被認(rèn)為是一個(gè)T細(xì)胞增殖的共刺激信號(hào)。本研究MITTV－H22瘤苗免疫后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞表達(dá)CD69增多，表明活化淋巴細(xì)胞的能力增強(qiáng)。

細(xì)胞周期反映細(xì)胞增殖過(guò)程，按其染色體行為而人為分為 G1期(DNA合成前期 )、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有絲分裂期)，細(xì)胞經(jīng)上述四期而完成其增殖，其中暫時(shí)脫離細(xì)胞周期不進(jìn)行細(xì)胞增殖的細(xì)胞稱(chēng)為G0細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量可將細(xì)胞分為G0/G1期(DNA為二倍體)、G2/M期(DNA為四倍體)和S期(DNA介于二者之間)。S期和G2/M期細(xì)胞均為增殖期細(xì)胞，其細(xì)胞比例可反映細(xì)胞的增殖活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MITTV－H22瘤苗免疫小鼠其腹腔巨噬細(xì)胞可使淋巴細(xì)胞S期和G2/M期的細(xì)胞比例增加，顯示淋巴細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，表明巨噬細(xì)胞活化淋巴細(xì)胞能力增強(qiáng)。

總之，MITTV－H22免疫小鼠，可使其腹腔巨噬細(xì)胞表面MHC－Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)升高，吞噬活性明顯增強(qiáng)，誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞表面分子CD69表達(dá)增高并使脾淋巴細(xì)胞G2/M期和S期的比例升高。提示MITTV－H22瘤苗免疫接種可提高巨噬細(xì)胞的功能，使其更好地在抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用。

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