內(nèi)皮細(xì)胞缺氧后miR-210、miR-92a、miR-126表達(dá)及意義

劉 芬，婁遠(yuǎn)蕾，阮瓊芳，謝 安，李 勇，崔蘇萍，汪 泱

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌330006)

研究證實，臟器缺血缺氧后可出現(xiàn)代償性的血管新生;microRNA與血管新生密切相關(guān)。在生物體的生長、發(fā)育及疾病發(fā)生中起重要作用［1］。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腎缺血后可出現(xiàn)血管新生，且microRNA(如 miR-210、miR-92a、miR-126)出現(xiàn)明顯改變［2］，但microRNA調(diào)控腎血管生成的機(jī)制尚不明確。2010年2～6月，我們觀察了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧后血管新生相關(guān)microRNA的表達(dá)變化，旨在為microRNA調(diào)控缺血缺氧后血管生成機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗細(xì)胞:人微血管內(nèi)皮HMEC細(xì)胞:購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司。主要試劑及儀器:Trizol Reagent(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司);核酸和蛋白分析儀(美國Bekman公司)，ABI 7500實時定量 PCR系統(tǒng)(ABI，美國)，CO2孵箱(美國熱電公司)，低氧培養(yǎng)箱(日本三洋公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞缺氧模型制作 將1×106個/ml的HMEC細(xì)胞接種于含20%FBS和EGF(10 ng/ml)M199培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，隔天換液。待細(xì)胞貼壁生長、增殖至約80%融合時，0.25%EDTA胰蛋白酶消化傳代。更換不含血清及EGF的M199培養(yǎng)液后分為兩組。缺氧組置于37℃低氧培養(yǎng)箱，通入5%CO2、94%N、1%O2混合氣體，低氧培養(yǎng)6 h;對照組置于5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 觀察項目 ①細(xì)胞形態(tài):于光學(xué)倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并照相。②細(xì)胞miR-210、miR-92a、miR-126表達(dá):采用實時定量PCR法。收集細(xì)胞，采用Trizol法抽提總RNA，核酸測定儀測A260/A280(要求為 1.8 ～2.0)，1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。采用stem-loop引物行miR-210、miR-92a、miR-126 逆轉(zhuǎn)錄［3］，反應(yīng)條件:16 ℃、30min;30 ℃、30 s，42 ℃、30 s，50 ℃、1 s，共 60 個循環(huán);70℃、15min。以U6為內(nèi)參，采用SYBR GreenI qPCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢測系統(tǒng)為ABI 7500 real time PCR system，反應(yīng)條件:95 ℃、10min，95 ℃、15 s，60℃、30 s，40個循環(huán)。最后行融解曲線分析。每個樣本設(shè)3個重復(fù)管，同時設(shè)無模板陰性對照。基因表達(dá)的相對變化以2－△△Ct表示。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件行統(tǒng)計學(xué)處理，計量數(shù)據(jù)資料用±s表示。組間差異比較采用小樣本t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài) 與對照組比較，缺氧組細(xì)胞增殖變慢，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，貼壁細(xì)胞減少，懸浮細(xì)胞增多。

2.2 miR-210、miR-92a、miR-126 表達(dá) 與對照組比較，觀察組 miR-210、miR-92a、miR-126分別上調(diào)了(5.19 ±0.99)、(3.02 ±0.88)、(3.87 ±0.83)倍，P 均 ＜0.05。

3 討論

microRNAs是一組21-25 nt長的非編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，能通過堿基配對與mRNA分子的3'非翻譯區(qū)相結(jié)合，降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA能夠通過調(diào)控與內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)基因的表達(dá)參與內(nèi)皮細(xì)胞和血管功能的調(diào)節(jié);尤其是一些血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性和高表達(dá)的microRNA，在血管的病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。文獻(xiàn)報道，過表達(dá)miR-92a于正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上可阻斷血管出芽，抑制血管網(wǎng)形成及內(nèi)皮細(xì)胞遷移［4，5］。Wang等［6］發(fā)現(xiàn)，抑制糖尿病大鼠來源的微血管內(nèi)皮miRNA-320表達(dá)可促進(jìn)血管內(nèi)皮增殖和遷移。當(dāng)大鼠miR-126缺失時，其血管完整性破壞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管生成缺陷，將導(dǎo)致血管滲漏、出血及部分胚胎致死，而存活的miR-126缺失大鼠在心梗時也出現(xiàn)血管新生缺陷［7］。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆襯于全身血管和淋巴管內(nèi)面的單層扁平細(xì)胞，在維持血管完整性、血管新生及創(chuàng)傷愈合中起重要作用，也是最先感受缺氧的細(xì)胞之一。研究證實，缺血臟器組織內(nèi)皮特異性microRNA如 miR-210、miR-92a、miR-126 表達(dá)升高［7，8］。本研究證實HMEC細(xì)胞缺氧后內(nèi)皮特異性 miR-210、miR-92a、miR-126均明顯上調(diào);提示缺氧可促進(jìn)內(nèi)皮特異性microRNA表達(dá)改變，此可能為缺氧后血管新生的機(jī)制。

Fish等［9］研究證實，miR-126是通過負(fù)調(diào)控其靶基因Spred1和磷酸激酶-3調(diào)節(jié)亞基2(PIK3R2/p85-beta)從而促進(jìn)血管新生的;而 Spred1和PIK3R2是VEGF信號通路的負(fù)調(diào)控因子。有報道，miR-210可通過促紅細(xì)胞生成產(chǎn)生肝細(xì)胞受體/ephrin配體，而Eph/ephrin信號通路介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)調(diào)控血管新生［10］。我們前期的體內(nèi)實驗亦已證實，腎缺血性損傷后可出現(xiàn)代償性血管新生，缺氧可誘導(dǎo)miRNA-92a、miRNA-210表達(dá)上調(diào)，與血管新生相關(guān)的信號分子VEGF表達(dá)亦升高。結(jié)合生物學(xué)分析推測，miRNA-210、miRNA-92a均可直接或間接靶向VEGF，miRNA/VEGF-Notch1可能是腎缺血性損傷后血管新生的主要調(diào)控通路［11］。

綜上所述，缺氧可促使內(nèi)皮細(xì)胞特異性microRNA表達(dá)改變;此可能為缺氧后血管新生的調(diào)控機(jī)制。關(guān)于缺氧后內(nèi)皮特異性microRNA與血管新生相關(guān)信號分子表達(dá)的變化有待于進(jìn)一步闡明。

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