植物高光效基因工程研究進展

張忠梁，張名昌，白云鳳，閆建俊，馮瑞云

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原030032）

植物的光合產物是人類賴以生存的物質基礎。根據光合作用中CO2的同化途徑，植物可分成C3，C4和CAM三類。C3植物通過1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）催化1,5-二磷酸核酮糖（RuBP）羧化，直接同化大氣中的CO2，產生2個三碳化合物3-磷酸甘油酸，該途徑稱為C3途徑（或卡爾文循環）[1]。Rubisco還催化加氧反應，使羧化合成的碳水化合物被氧化，固定的能量重新被釋放。Rubisco催化反應的雙重性以及對CO2的高Km值是C3植物低光合效率的主要原因。C4植物CO2的初始固定由位于葉肉細胞的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）所催化，該酶對CO2的結合能力特別強，催化空氣中的CO2與其受體磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）形成四碳化合物草酰乙酸（OAA），該途徑稱為C4途徑。在C4途徑中，OAA經葉綠體中的NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）還原為蘋果酸（MA），MA再轉運至鞘細胞中脫羧，釋放出的CO2進入C3循環被Rubisco固定，而余下的三碳產物（丙酮酸）重新運回葉肉細胞的葉綠體內，在磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）催化下形成CO2受體PEP。C4循環增加了維管束鞘細胞中CO2的濃度，同時提高了Rubisco的羧化活性，抑制了它的加氧活性，使C4植物保持較高的光合效率[2]。

一些主要農作物如水稻、小麥、馬鈴薯、甜菜等均為C3作物，較低的光合效率成為限制其產量進一步提高的重要內在因素之一。通過提高光合作用效率來增加作物產量一直是國際上光合作用研究和作物遺傳育種研究的熱點之一。自20世紀60年代以來，人們試圖通過常規雜交育種手段來改進C3植物的光合效率，但未取得預期結果。近年來，基因克隆和轉基因技術逐步完善，為改善作物光合效率提供了新途徑。本文就該方面的研究進展作一綜述。

1 Rubi sco的修飾與改造

Rubisco廣泛分布于具有光合功能的細胞器中。在C3植物中，Rubisco主要存在于葉肉細胞的葉綠體間質中，在基粒片層上也有少量分布。在C4植物中，Rubisco則定位于維管束鞘細胞中的葉綠體間質內。Rubisco由多個大亞基和小亞基組成，大亞基具有催化功能，小亞基僅具有調節作用。Rubisco催化C3途徑的第1步，即把CO2分子共價結合到底物RuBP（1，5-二磷酸核酮糖）上，形成3-磷酸甘油酸。但其羧化反應速度每秒只有2～3次，與一般的酶促反應速度（每秒25 000次左右）相比，效率極低。Rubisco是一種雙功能酶，還催化另外1個反應（即加氧反應，即Rubisco不與CO2結合而是與O2結合，除消耗能量外，還損失羧化反應中固定的20%～50%的有機碳）。

提高Rubisco同化CO2的效率，抑制其加氧功能，無疑會提高作物產量。許多研究者希望通過基因定點突變改變酶的結構，以改變Rubisco羧化/加氧的比值，但至今仍未獲得成功，突變后的酶活性并未顯著提高。1994年，Read和Tabita發現在硅藻和紅藻中存在的Rubisco具有比高等植物高得多的效率。此后，Uemura等又發現一種嗜熱紅藻的Rubisco羧化效率約是高等植物的2.5～3倍。在紅藻中發現的具有較高效率的Rubisco，為修飾改造Rubisco提供了依據。Whitney等[3]通過質體轉化的方法將紅藻Rubisco的小亞基編碼基因引入煙草的葉綠體中，得到了高效表達，但是表達的小亞基卻不能與煙草本身的大亞基組裝成全酶。因此，要提高Rubisco的效率需要進一步了解該酶的蛋白結構與其催化效率之間的關系及其大小亞基組裝成全酶的修飾機制。

2 C4光合途徑中關鍵酶基因的克隆與轉化

C4光合途徑中主要涉及3種關鍵酶，即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸丙酮酸二激酶（PPDK） 和依賴于 NADP的蘋果酸酶（NADP-ME）。PEPC可分為C4型、C3型和根型。C4型主要負責C4雙羧酸循環途徑中固定CO2的初始反應，C4光合循環的關鍵限速酶[4]。將玉米的C4型PEPC基因導入水稻，葉片的PEPC活性提高了20倍[5]，甚至提高110倍[6]；導入小麥，酶活性提高了3～5倍[7]；導入煙草，酶活性最高提高了2.4倍。將高粱的C4型PEPC基因導入水稻，酶活性提高5～10倍[8]，導入擬南芥[9]，PEPC的活性也比對照有不同程度的提高。將甘蔗的PEPC基因導入煙草，酶活性提高1.5倍[10]。

PPDK分為C4型和胞質型。C4型PPDK基因與胞質型PPDK基因往往有部分重疊[11]，如玉米C4型PPDK基因與胞質型PPDK基因的大部分序列相同，區別在于C4型PPDK基因的上游比細胞質型PPDK基因多1個外顯子和1個內含子，外顯子編碼1個葉綠體導肽，而內含子的部分序列則成為細胞質型PPDK基因的啟動子，具有組成型轉錄活性[12]。將玉米的C4型PPDK基因轉入水稻，PPDK的最高酶活力提高了40倍[13]；轉入馬鈴薯，PPDK的最高酶活力提高了5.4倍；轉入擬南芥，酶活力提高了4倍。

NADP-ME由1個小的基因家族編碼。C4型NADP-ME位于維管束鞘細胞的葉綠體的基質中，通過其脫羧反應生成的CO2被Rubisco重新固定而進入C3循環，是C4途徑的另一關鍵酶。高粱和玉米[14]的NADP-ME基因均在水稻植株中得到了有效表達，水稻轉基因植株的生物學產量不僅顯著高于非轉基因水稻植株，也高于轉PEPC基因和PPDK基因的水稻植株[15]。

3 植物高光效基因工程面臨的挑戰

C4關鍵酶基因向C3作物的成功導入及其在C3作物中的高效表達，說明利用基因工程手段培育高光效作物品種的可行性，但仍有許多問題需要進行深入系統的研究。如Ku等得到的轉基因水稻，其PEPC活力可達玉米的2～3倍，但是除了其抗氧抑制的能力有所增強外，并未發現光合效率有所提高。轉基因植物中PEPC活力的提高，必然使其產物——草酰乙酸（OAA）的濃度升高；如果生成的OAA不能迅速脫羧或被轉運掉，其PEPC活力就會被OAA強烈抑制，因而就難以實質性地啟動單細胞內的四碳雙羧酸微循環而有效提高轉基因作物中四碳雙羧酸濃度，最終不能有效提高光合效率。這些結果表明，要顯著提高轉基因植株的光合效率，需要引入完整運行的C4循環。為此，需要導入多個C4基因并使其協調表達，或者把含不同C4基因的植株彼此雜交，聚合C4基因。

分析C4基因超量表達的例子，發現單子葉植物玉米、高粱的C4基因在水稻、小麥等單子葉植物中的表達水平一般高于在雙子葉植物如煙草、擬南芥中的表達水平，表明系統發生學上的距離有可能影響C4基因在C3植物中的高效表達。對單子葉植物玉米的密碼子用法分析表明，其與水稻、小麥等單子葉植物的密碼子用法比較一致，與擬南芥、煙草等雙子葉植物差異較大[16]。對雙子葉植物籽粒莧NAD-ME的密碼子用法的研究，發現它與馬鈴薯、擬南芥、葡萄等雙子葉植物的用法較為一致，與玉米、高粱等單子葉植物差異較大[17]。密碼子偏好性是生物在長期的進化過程中為適應宿主的基因組環境而形成的。因此，如何選擇高光效基因的適宜供體和受體應是高光效基因工程考慮的重要因素之一。

［1］梅楊，李海藍，謝晉，等.核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）[J].植物生理學通訊，2007，43（2）：363-368.

［2］MakotoM，Robert T F，HiroshiF，etal.Molecular engineeringof C4photosynthesis[J].Annu Rev Physiol Plant Mol Biol，2001，52：297-314.

［3］Whitney SM，Andrews T J.The gene for the ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase（Rubisco）smallsubunit relocated to the plastid genome of tobacco directs the synthesis of small subunits that assemble into Rubisco [J].Plant Cell，2001，13：193-205.

［4］ Bailey K J，Battistelli A，Dever L V，et al.Control of C4photosynthesis:effects of reduced activities of phosphoenolpyruvate carboxylase on CO2assimilation in Amaranthus edulis L[J].J Exp Bot，2000，51：339-346.

［5］焦德茂，李霞，黃雪清，等.轉PEPC基因水稻的光合CO2同化和葉綠素熒光特性[J].科學通報，2001，46（5）：414-417.

［6］ Ku M SB，Agarie S，Nomura M，et al.High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants[J].NatBiotech，1999，17：76-80.

［7］陳緒清，張曉東，梁榮奇，等.玉米C4型PEPC基因的克隆及其在小麥的轉基因研究 [J].科學通報，2004，49（19）：1976-1982.

［8］張方，遲偉，金成哲，等.高粱C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分子克隆及其轉基因水稻的培育 [J].科學通報，2003，48（14）：1542-1546.

［9］ Lebouteiller B，Gousset-Dupont A，Pierre J，et al.Physiological impactsofmodulating phosphoenolpyruvate carboxylase levels in leaves and seeds of Arabidopsis thaliana[J].Plant Science，2007，172：265-272.

［10］楊榮仲，譚裕模，張木清，等.甘蔗C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因轉化煙草研究初報 [J].熱帶植物學報，2004，25（2）：61-65.

［11］王原媛，白云鳳，張定宇.植物PPDK基因在基因工程中的應用[J].山西農業科學，2010，38（8）：88-91.

［12］Sheen J.Molecularmechanisms underlying the differential expression ofmaize pyruvate orthophosphate dikinase genes[J].PlantCell，1991，3：225-245.

［13］ Fukayama H，Imanari E，Tsuchida H，et al.In vivo activity of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants[J].PlantCellPhysiol，2000，41（supplement）：112.

［14］季本華，朱素琴，焦得茂.轉玉米C4光合酶基因水稻株系中的光合 C4微循環[J].作物學報，2004，30（6）：536-543.

［15］袁莉民，仇明，王朋，等.C4轉基因水稻葉片氣孔與葉鞘維管束結構特征[J].中國農業科學，2006，39（6）：902-909.

［16］劉漢梅，何瑞，趙耀，等.玉米密碼子用法分析[J].核農學報，2008，22（2）：141-147.

［17］李平，白云鳳，馮瑞云，等.籽粒莧蘋果酸酶NAD-ME基因密碼子偏好性分析[J].應用與環境生物學報，2011，17（1）：12-17.