同種異體間充質干細胞的成骨誘導聯合益骨湯治療骨缺損的研究

哈爾濱醫科大學附屬第一醫院（150001）宋烜赫 楊衛良

骨缺損引起的相關疾病是嚴重影響人生活質量和社會勞動力的常見病。長期以來，骨缺損修復都屬于重要的研究課題，迄今為止，臨床對創傷、感染和腫瘤切除后所造成的大范圍骨缺損的修復仍未得到有效的解決。人們嘗試過很多治療方法，但均存在一定的問題和缺陷。如自體骨的移植，其來源有限且對機體產生新的創傷，在臨床中很難實現，意義不大；異體骨移植存在免疫排斥反應，影響治療效果；一般的人工合成替代物植入后常會引起感染、假體松動及異物反應等并發癥。有材料表明，間充質干細胞的抗原性較弱[1]，如能以同種異體間充質干細胞與組織工程材料相結合，在體內及體外誘導生成骨組織，將為骨缺損的治療開辟一個嶄新的領域。間充質干細胞是具有多向分化功能的細胞，其在成體細胞中含量極少，但可以通過分離提純及擴增培養大量獲得，并在定向誘導劑的作用下向成骨方向轉化。本實驗鑒于上述情況開展了間充質干細胞進行成骨誘導并治療骨缺損研究，希望能找到新的更合適的骨源，并在其基礎上進行自擬中藥復方益骨湯對骨缺損輔助治療作用的探討。

1 材料和方法

1.1 MSCs的分離培養 選取雄性大白兔，體重為2.5kg±500g。用含肝素30u/ml的注射器于股骨粗隆抽取骨髓2ml加入含10%胎牛血清和青霉素及鏈霉素的DMEM培養基（Gibsco公司）中，吹打混勻，置培養瓶中，37℃、5%C02、95%相對濕度的孵育箱內培養。5d后半量換液，1周后全部換液，以后每周換液2次，逐步去除未貼壁細胞。14d后貼壁細胞匯合到90%生長面積時，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，取第2代MSCs備用。

1.2 MSCs纖維蛋白復合物的制備 取第2代細胞計數后制成5.0×106/ml的細胞懸液，按1∶1與纖維蛋白（醫用安可膠）混合，置12孔培養板、37℃孵育箱內聚合1h，收縮過夜后備用。用條件培養液培養誘導3天，誘導MSCs向成骨細胞分化。

1.3 骨缺損模型的制作及處理 選用4～5個月齡清潔級雄性日本大耳兔20只（哈爾濱醫科大學動物中心提供），重2.5kg±500g。3%戊巴比妥30 mg/kg耳緣靜脈麻醉，取膝關節外側切口顯露股骨髁, 用手鉆在股骨髁外側寬大處制作0.6cm×1.0cm的松質骨缺損。沖洗干凈骨屑后，將同種異體MSCs復合物植入大白兔股骨缺損處。實驗組用益骨湯灌胃，按照人/兔體表面積換算服藥量，1次/d，對照組采用相同方法以蒸餾水替代中藥湯劑。術后不固定肢體，分籠飼養，連續3 d使用青霉素預防感染。

1.4 術后觀察 觀察動物的進食、活動和切口愈合情況。分別于術后8、12、16、24周進行骨密度測定及鏡下組織觀察，以了解骨缺損的修復。各期用空氣栓塞法處死動物5只，大體觀察缺損區修復情況，切取股骨標本，用10%中性福爾馬林溶液固定，脫鈣切片后HE染色，光鏡下觀察新生骨痂和骨缺損愈合情況。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞體外培養及誘導情況 骨髓用淋巴細胞分離液分離出的細胞為較單一的圓球形細胞，倒置顯微鏡下觀察，見原代細胞培養24小時后大部分細胞貼壁生長，細胞逐漸從圓球形變成短梭形、長梭形，形態飽滿。72小時后貼壁細胞分裂增殖明顯，并逐漸形成細胞團、集落。以后集落不斷增大，相互匯合，約12d后細胞鋪滿培養瓶底。有些不貼壁的細胞，呈圓形，大部分隨換液除去。傳代約4小時后細胞開始貼壁，貼壁細胞呈梭形、多角形，傳代后細胞形態無明顯變化，但增殖速度加快。

2.2 ALP測定結果 細胞經條件培養液誘導培養后，ALP活性明顯增高，3天后實驗組即明顯高于對照組，隨后實驗組逐漸升高，8天左右達到高峰，其后稍有下降，但仍高于對照組。ALP測定結果提示經誘導培養的細胞具有較強堿性磷酸酶活性。2.3 放射學檢查 實驗組：術后第8周骨缺損區兩斷端有少量骨痂形成；術后第12周骨缺損區兩斷端有大量模糊骨痂形成；術后第16周骨缺損區新骨密度增高，部分骨皮質連續；術后第24周骨缺損區新骨塑形好，骨皮質連續，新骨髓腔較通暢。對照組：術后第8周骨缺損區無明顯變化；術后第12周缺損區骨兩斷端出現少量骨痂陰影；術后第16周缺損區有模糊骨痂生長，骨痂向移植物長入；術后第24周缺損區骨痂生長逐漸增多，兩斷端連接不完全，新骨再生塑形差，髓腔未再通。

3 討論

MSCs是一種可以分化為多種中胚層細胞的成體干細胞，有證據表明MSCs具有體外成鈣、體內成骨的能力。近年基于此的組織工程取得了諸多進展，主要表現在以自體骨髓MSCs為種子細胞復合不同載體修復各類骨缺損的實驗研究和初步的臨床應用。但自體MSCs的回植須經歷抽取骨髓、培養擴增及質量控制檢測等階段[2]，并且自體骨髓MSCs的增殖、成骨分化能力隨著年齡的增加而減弱[3]，不適合臨床應用。

Arinzen等[2]使用同種異體MSCs復合羥基磷灰石-磷酸三鈣成功修復了狗股骨的節段性骨缺損，并指出其修復效果與自體MSCs相似，明顯優于無細胞植入組。骨缺損的研究多采用皮質骨節段性骨缺損為模型，但也有研究員指出兔股骨髁0.6 cm×1.2 cm的松質骨缺損不能自行愈合[4]。本實驗也支持這種觀點，兔股骨髁的松質骨缺損模型是可行的。

國內外的許多學者也嘗試了中藥在骨折愈合中的作用并進行了大量的研究[5～8]。周重建[9]發現，使用益氣化癖中藥能促進骨折斷端及其周圍毛細血管的開放量，而且多核巨噬細胞活性明顯增強。林燕萍也報道[10]，服用煅狗骨后骨折處的血腫吸收和機化明顯快于對照組，認為煅狗骨具有活血通絡、健脾生肌的效應。另有學者[11][12]發現，肢傷三方（續斷、當歸、白芍、土鱉等）具有刺激大白兔骨折局部新生毛細血管網的形成，改善骨折局部的血液循環，加快新陳代謝，強有力地刺激成骨細胞的活性。同時在骨折愈合處I型膠原表達增強。林潤臺[13]通過對骨折愈合過程中超微結構的研究發現，用丹參后成纖維細胞核仁有著邊、核凹陷的現象，特別是形成膠原的粗面內質網容量增加。由此推測成纖維細胞蛋白質合成旺盛，有利于產生更多的膠原纖維，促進骨折愈合。

本實驗應用益骨湯，其藥物組成為骨碎補、丹參、川牛膝、枸杞子、山藥、炒山楂、薄荷和陳皮。其中，骨碎補，味苦，性溫，入肝、腎經，功用補腎強骨，活血止血，續傷止痛，不但可治療腎陽不足之骨萎肉卻而治本，亦可活血通絡而治病之標。川牛膝，味苦、酸，性平，歸肝、腎經，功用活血通經、引血下行、補肝腎、強筋骨、利水通淋。川牛膝之于治療骨蝕，亦屬于既能補遺強壯、又能活血通利的標本同治之品。枸杞子，味甘質潤而性平，功用滋補肝腎、益精養血，長于治療腎精肝血不足所致髓枯骨殘。骨碎補和枸杞子，一療腎之元陽不足而冷痹骨萎，一療腎之陰精不充而髓枯骨萎，二者相互配合，共同切中腎虛骨萎的核心病機。丹參，味苦而性微寒，可活血通痹。《別錄》稱其主“腰脊強、腳痹”，亦以清通氣血之功，而能除血瘀血熱、宣絡蠲痹，治療骨節疼痛、四肢不遂，亦可助諸般補益肝腎之品達于病所，而收治療骨萎之功。山藥，味甘，性平，歸脾、肺、腎經，功用益氣養陰、補脾肺腎。其具備的補中益氣而溫養肌肉與益腎固精而療腎虛腰痛的雙重功效，使其成為治療骨萎之證所必須。陳皮，味苦辛而性溫，歸脾、肺經，可理氣健脾、祛濕消痰。蓋脾氣健運，氣機調暢，經絡痰濕得消，則可助精微消化、吸收、布散以調治骨萎。炒山揸，味酸、甘，性微溫，歸脾、胃、肝經，功效消食化積、行氣散瘀，亦可助精微消化、吸收、布散以調治骨萎。薄荷，味辛，性涼，歸肺、肝經，其力能內透筋骨、外達肌表、宣通臟腑、貫串經絡。故對于肝失調達、肝氣郁結所致之氣血阻滯、骨髓脈絡失養之病機，以薄荷最宜。

在中藥對于細胞及生長因子的調節機制研究中，林燕萍[10][14][15]等發現，煅狗骨促進垂體TSH細胞功能的同時也促進OH細胞功能，促進甲狀腺素的分泌，并認為鍛狗骨可能通過甲狀腺激素和生長激素的直接或間接作用，刺激骨折斷端的成骨細胞和破骨細胞的活性，促進新生骨小梁的形成，最終促進骨折的愈合。劉獻祥[15]用免疫組化技術進行圖像定量分析的結果表明，中藥（補腎復方）能明顯提高骨折模型家兔骨折處骨癡DNA指數和BMP含量，促進和誘導BMP的合成，加速骨折愈合。

本實驗相同時期實驗組與對照組相比有明顯改變：①中藥治療組明顯促進和縮短骨缺損修復時間；②使用中藥治療后血腫吸收和機化時間明顯縮短；③服用中藥期間，間充質細胞呈梭形改變明顯，骨核細胞濃縮，染色質凝聚靠邊，有大量的膠原纖維，細胞質容量的增加，特別是形成膠原纖維的粗面內質網容量增加。結果表明，同種異體間充質干細胞的成骨誘導輔以中藥益骨湯治療骨缺損，不但能有效縮短病程，提高患者生活質量，減輕患者痛苦，而且中醫的辨證論治方法可以實現真正的個體化治療，即針對不同人群的不同體質骨破損后產生的不同癥狀遣方用藥，避免了重復用藥的弊端。此外，中藥制劑方便易尋，價格低廉，便于推廣應用。