青蒿琥酯抑制MDA-MB-231細胞增殖的機制探討

趙小波，幸天勇，高硯春

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科，四川 南充 637000)

近年研究發(fā)現(xiàn)，雌激素陰性的較雌激素陽性的乳腺癌患者，腫瘤細胞的遠處轉移及侵襲能力更強，預后更差［1］。中藥在提高癌癥患者的生存質量、延長生存期等方面對雌激素受體陰性的乳腺癌治療發(fā)展帶來了新的契機。抗瘧藥青蒿琥酯(ART)是青蒿素衍生物，體內外實驗證實對肝癌細胞有誘導凋亡的作用［2，3］，對結腸癌等55種細胞株均有細胞毒作用［4］。國內尚未見ART對雌激素受體陰性乳腺癌細胞影響的相關報道。本實驗采用ER陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231為研究對象，探討ART抑制乳腺癌細胞作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及其配置

1.1.1 藥物:ART由廣西桂林第二制藥廠生產。60 mg ART由5%碳酸氫鈉1 ml配成儲備液，－20℃保存。實驗時用1640液稀釋所需濃度，碳酸氫鈉的終濃度＜0.09%

1.1.2 試劑:RPMI-1640(購于美國 Hyclone公司)，10%小牛血清(購于杭州四季青生物工程材料有限公司)，80 mg/L青霉素及120 mg/L鏈霉素(購于重慶醫(yī)大附一院藥房)，MTT(購于Sigma公司)。

1.1.3 免疫細胞化學:抗 Bax、抗 P21WAF1/CIP1、抗Bcl-2單克隆抗體(鼠抗人)、抗nm23多克隆抗體(兔抗人)及SP－9000(通用型)試劑盒，DAB試劑盒購于北京中山生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理:MDA-MB-231購于中科院上海生物研究所細胞庫。用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。細胞長至瓶底80% －90%時處于對數(shù)生長期，用0.05%胰酶和0.02%EDTA混合液消化后，5分鐘800轉離心，棄上清液，制成單細胞懸液即可備用。

1.3 MTT比色法檢測細胞增殖功能

1.3.1 實驗分組:分為空白對照組、細胞對照組、溶劑對照組(0.09%NaHCO3)、藥物組(2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)共9組。

1.3.2 步驟:將 5.0 ×104/ml濃度細胞加入96 孔板中，200μl/孔。培養(yǎng)24小時后，細胞貼壁，分別加入不同處理因素。每組設8個平行孔，在額定的時間取出培養(yǎng)板，吸去各孔培養(yǎng)液，換上200μl無血清1640并加入20μl的MTT(5 mg/ml)，輕振培養(yǎng)板，放回CO2孵箱中再培養(yǎng)4小時后，10分鐘4000轉離心，棄上清液，加DMSO200μl/孔，振蕩器上振蕩(5－10)分鐘，空白調零，在微量板讀數(shù)儀中測出每孔中600 nm處的OD值。并計算出ART對乳腺癌細胞的抑制率，重復3次。

乳腺癌細胞存活率=抗癌藥物組吸光度值/細胞對照組吸光度值×100%

乳腺癌細胞抑制率=1－乳腺癌細胞存活率

1.4 免疫細胞化學檢測

1.4.1 步驟:細胞爬片用PBS洗兩次。過氧化氫孵育10分鐘，TritonX－100/PBS穿孔，1%胰酶37℃消化30分鐘，PBS沖洗后，滴加試劑1(正常三羊血清)封閉無關抗原，室溫孵育(10－15)分鐘，滴加適當一抗工作液，4℃冰箱過夜，滴加生物素二抗，室溫孵育，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色，復染，酸酒精褪色后封片。

1.4.2 判斷標準:參照 Lessey［5］等判斷標準，陽性細胞染成棕黃色，用HSCORE系數(shù)作半定量評分。計算出100個細胞中各強度的百分比，求HSCORE的值，并取其平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理:實驗采用SPSS 11.0軟件包進行方差分析。MTT數(shù)據(jù)結果采用重復測量資料的方差分析法進行統(tǒng)計分析，免疫細胞化學檢測結果采用單因素方差分析，p＜0.05有統(tǒng)計學意義

2 結果

2.1 MTT比色法結果:細胞對照組與NaHCO3組的吸光度值之間無顯著性差異，說明溶劑NaHCO3液對MDA-MB-231細胞生長無影響。ART對MDAMB-231細胞有抑制作用，隨作用濃度和作用時間的增加，藥物的抑制作用加強，有劑量－效應和時間依賴的趨勢，見表1。

表1 MTT法檢測不同濃度、不同時間的青蒿琥酯對MDA-MB-231細胞的作用

2.2 免疫細胞化學檢測結果:乳腺癌細胞中Bcl-2蛋白質表達定位于細胞漿，PCNA蛋白質表達定位于細胞核，VEGF蛋白質在細胞漿和細胞核中都有陽性顆粒的表達。方差分析結果顯示:ART2 μmol/L作用72小時后，MDA-MB-231細胞 PCNA、VEGF蛋白質的表達與細胞對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，BcL-2蛋白質的表達與細胞對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，見表2。提示青蒿琥酯有下調PCNA、VEGF蛋白質的表達，抑制乳腺癌細胞株增殖的作用。

表2 ART影響增殖凋亡調控及轉移相關蛋白質的表達

3 討論

ER陰性乳腺癌多見于年輕、絕經前婦女，腫瘤分化程度低，病人預后較差。ART是目前最有效一線抗瘧藥，青蒿素控制瘧疾的機制在于它能夠與瘧原蟲體內的高濃度鐵離子發(fā)生反應，產生自由基活性代謝物，損傷機體細胞膜結構和烷化生物大分子。腫瘤細胞分裂時需要大量鐵離子才能復制DNA，故腫瘤細胞的鐵含量明顯高于正常細胞，因此可引入青蒿素有選擇地殺死癌細胞［6］。Sertel［7］等證實ART對部分腫瘤細胞有殺傷及抑制增殖的作用，實驗結果表明，ART有明顯殺傷及抑制ER陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231生長的作用，機制可能與下調PCNA、VEGF蛋白質的表達有關。如果臨床將ART應用于ER陰性乳腺癌的化療上有重要的意義。

PCNA是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，在DNA復制過程中起重要的調節(jié)作用，也是一種細胞周期調節(jié)蛋白，其表達隨細胞周期而變化。PCNA表達量的增加同多種惡性腫瘤分化程度、組織學分級密切相關。如果PCNA不表達、低表達或無功能，將發(fā)生凋亡［8］。故目前許多學者已把PCNA的陽性表達作為乳腺癌一個有用的預后指標［9］。本實驗結果表明20μmol/LART能明顯抑制PCNA表達，從而降低DNA聚合酶δ的活性，抑制腫瘤細胞DNA的合成，這可能是ART抗腫瘤增殖作用的機制之一。

研究表明，許多腫瘤均表達VEGF及其受體。由于VEGF在腫瘤血管生成方面的重要作用，它已成為阻斷腫瘤血管形成的理想靶點和早期乳腺癌的獨立預后因子［10］。Mattern 等［11］認為 VEGF 不僅作為旁分泌因子可刺激血管內皮細胞增殖，同時還可能作為自分泌因子，通過直接作用于腫瘤細胞本身的VEGF受體而促進其生長。雌激素受體陰性的MDA-MB-231細胞中已經檢測出VEGF-C的高表達［12］。本實驗將20μmol/L ART作用MDA-MB-231細胞72小時后，免疫細胞化學結果顯示細胞中VEGF蛋白表達下調，說明ART抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞增殖還可能與其抑制VEGF表達，自分泌作用減弱有關，提示ART有潛在的抗血管生成活性［13］。

終上所述，ART有抑制MDA-MB-231細胞增殖的作用，其機制可能于下調PCNA和VEGF蛋白質表達有關。ART可能對ER陰性乳腺癌的臨床化療提供新的治療思路。

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