大劑量BOP(N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺)誘導(dǎo)了金黃地鼠肝內(nèi)膽管癌而非胰腺癌*

吳澤珊，蒲 宇，沈成義，向 宇，蹇順海，謝賢鏞，文 彬，張小明，楊正偉

(川北醫(yī)學(xué)院，1.形態(tài)定量研究室;2.醫(yī)學(xué)影像研究所;3.病理生理研究室;4.附屬醫(yī)院病理科，四川 南充 637000)

胰腺癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，制備胰腺癌動物模型對于研究胰腺癌發(fā)生與發(fā)展機(jī)制非常重要。目前，國內(nèi)常用裸鼠建立種植性胰腺癌模型［1］;國外常用 BOP(N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine，N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺)誘導(dǎo)金黃地鼠胰腺癌，其特征與人類胰腺癌很相似［2］。BOP的常用劑量為10mg/kg體重，用藥后 30 周左右成模［2，3］。Ouyang等(2005)［4］用大劑量BOP來誘導(dǎo)金黃地鼠胰腺癌，用藥后18周成模。我們參考后一方法造模，結(jié)果沒有誘導(dǎo)出胰腺癌，而誘導(dǎo)了肝內(nèi)膽管癌。本文將我們的造模情況作一簡要報告。

1 材料與方法

1.1 動物及用藥:雌性敘利亞金黃地鼠(由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供)68只，用藥前年齡約(8－9)周，體重91克－109克。把動物隨機(jī)分為實驗組48只，對照組20只。給實驗組動物皮下注射用生理鹽水配制的BOP(C6H10N2O3，美國International Laboratory公司產(chǎn)品)，對照組動物注射等量生理鹽水。完全根據(jù)文獻(xiàn)［4］所述劑量和方法，實驗組每個動物每周注射1次BOP，共5次，首次劑量為70 mg/kg體重，后4次均為20mg/kg。

首次用藥8周(54天)后處死有明顯腹水的實驗組動物(10只)，從對照組隨機(jī)選擇6只處死;用藥12周(82天)后處死余下存活的實驗組動物(7只)，并再從對照組隨機(jī)抽選6只動物處死，其余對照組動物用于其他實驗。

1.2 組織病理學(xué):處死動物后立即取出肝臟和胰腺等內(nèi)臟器官，浸潤固定于Bouin液內(nèi)2天，然后在70%乙醇內(nèi)保存，(2－5)天后給器官稱重并切組織塊。通過肝臟中心區(qū)域隨機(jī)切取1組織薄片，然后從該薄片間隔切取2個組織塊;沿垂直于胰腺長軸的方向，把胰腺切成3－4個組織塊。組織塊經(jīng)常規(guī)石蠟(德國Leica公司)包埋，每個肝臟和胰腺各包埋2個蠟塊;從每個蠟塊切1張7μm厚的切片(所用肝臟和胰腺切片的平均面積分別約為54、39 mm2)，常規(guī)作HE(蘇木素+伊紅)染色。

1.3 體視學(xué):用×20物鏡觀察肝臟切片，在電腦顯示器上觀察切片圖像(最后放大倍數(shù)×535)，用電動載物臺(川北醫(yī)學(xué)院與四川大學(xué)、北京馳馬特圖像技術(shù)有限公司聯(lián)合研制)等距隨機(jī)抽選測試視野(從每張切片上平均抽選了36個視野)，并用體視學(xué)測格軟件(川北醫(yī)學(xué)院與北京馳馬特圖像技術(shù)有限公司聯(lián)合研制)在切片圖像上生成6個測點(diǎn)(“+”，點(diǎn)間距為125 ×175μm)，計數(shù)位于膽管管壁及管腔內(nèi)的測點(diǎn)數(shù)以及位于整個切片內(nèi)的測點(diǎn)數(shù)，由此估計肝內(nèi)膽管的體積分?jǐn)?shù)［5］。

2 結(jié)果

整個實驗期間，對照組動物沒有死亡。實驗組動物第8周取材前死亡20只，第12周取材前死亡共31只。動物死于互相撕咬、虛弱及腹水等(具體死亡原因未做詳細(xì)病理解剖分析)。

實驗組動物體重顯著減輕，實驗組第12周取材動物肝臟重量顯著增加(表1)。實驗組第8周取材的所有10只動物腹腔內(nèi)有(8－27)ml腹水，第12周取材的6/7只動物有(2－45)ml腹水;腹水呈淡黃或深黃色，清亮。

表1 主要結(jié)果(x－±SD)

對照組所有動物的胰腺和肝臟未見明顯的異常組織病理學(xué)變化，肝內(nèi)可見膽管主要為稀少的小葉間膽管(圖1和表1)。

實驗組所有動物胰腺的組織病理學(xué)基本正常(似有一定程度的間質(zhì)水腫和炎細(xì)胞浸潤)，未見任何癌變組織。除第12周組有1只動物“基本正常”(肝內(nèi)膽管略微擴(kuò)張)外，2組所有動物肝內(nèi)膽管異常增生，增生膽管占肝臟體積的14%–62%(表1)。膽管增生呈彌漫性，并向肝小葉結(jié)構(gòu)內(nèi)侵犯。增生的膽管上皮為單層立方、柱狀(圖2)，部分區(qū)域呈乳頭狀和不同程度的不典型增生(圖3)。除第12周組2只動物外，2組所有動物肝內(nèi)部分異常增生的膽管出現(xiàn)灶性癌變［6］，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞形態(tài)多樣，層次增加，細(xì)胞核極性消失，染色質(zhì)多而不均勻，可見病理性核分裂及“背靠背”或共壁征象(圖4)，甚至膽管結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞呈小巢狀分布(圖5)。增生膽管間殘存的肝細(xì)胞中有不少細(xì)胞腫大(圖1－圖5)，少量細(xì)胞有淤膽征象(圖2)。

3 討論

胰腺癌常用金黃地鼠造模，并常用小劑量BOP(例如10mg/kg)多次注射的方法，成模時間大約在首次用藥后30周左右［2，3］。我們也用了該法造模(以10mg/kg的劑量每周注射與本文一樣的BOP一次，共注射7次)，首次用藥后38周的確觀察到胰腺癌形成(正在研究中，尚未報告)。文獻(xiàn)［4］用大劑量BOP來誘導(dǎo)金黃地鼠胰腺癌，首次用藥后18周大多數(shù)動物都有胰腺癌形成［4］。本文采用該文獻(xiàn)所用方法造模，以期縮短造模時間，結(jié)果卻沒有造成胰腺癌，而造成嚴(yán)重肝損害，首次用藥后12周大多數(shù)動物都已死亡。筆者覺得這很難解釋，因為文獻(xiàn)［4］用的也是雌性敘利亞金黃地鼠(用藥前年齡5周，體重70克)。也許，大劑量BOP更易損害肝臟，動物存活困難，不適于建造胰腺癌模型。

肝內(nèi)膽管癌尚缺乏理想的動物模型。有趣的是，本研究所用大劑量BOP“碰巧”誘導(dǎo)出了肝內(nèi)膽管癌。人們常用亞硝胺類化合物［7］、呋喃［8］等致癌劑誘導(dǎo)大鼠，尤其是金黃地鼠(其膽道解剖［9］和膽汁［10］成分與人相似)肝內(nèi)膽管癌。事實上，有研究報告過小劑量BOP誘導(dǎo)膽管癌(成模率約20%)［11］;為增加造模成功率，人們常在 BOP 用藥的基礎(chǔ)上結(jié)合外科手術(shù)(膽囊小腸吻合)造模［7］。本研究顯示BOP用藥后絕大多數(shù)動物都出現(xiàn)肝內(nèi)膽管不典型增生及灶性肝內(nèi)膽管癌。因此，本研究結(jié)果無疑為進(jìn)一步探討用BOP創(chuàng)建肝內(nèi)膽管癌模型提供了重要參考依據(jù)。

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