酶聯免疫法檢測生乳中三聚氰胺的研究

三聚氰胺又名氰尿酰胺，學名三氨三嗪（C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，常被用作化工原料。三聚氰胺是一種非蛋白質含氮化合物，屬于難代謝物質，一旦進入人體或動物體內，能夠不同程度地導致腎衰竭或者是死亡，還能導致結石誘發膀胱和泌尿系統疾病。但是，由于其含氮量高達66.67%，不法商販抓住這一特點，向乳制品及飼料中添加三聚氰胺作為偽蛋白以提高產品的蛋白質含量，對食品安全造成很大危害。

近年來，發生在國內的“三鹿牌嬰幼兒奶粉事件”以及美國的數起飼料致死寵物的事件，使三聚氰胺的檢測成為全球關注的熱點。目前，國際食品法典委員會對食品中三聚氰胺的允許含量設立了新的標準。標準規定：嬰兒配方奶粉中三聚氰胺含量不得超過1 mg/kg，而其他食品或動物飼料中的三聚氰胺含量不得超過2.5 mg/kg。因此，如何高效快速地檢測食品中三聚氰胺的含量成為保護消費者生命安全至關重要的問題。

目前，生乳與乳制品中三聚氰胺殘留量檢測的方法主要有液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS）、氣相色譜——質譜聯用法（GC-MS和GC-MS/MS）。快速檢測法主要包括酶聯免疫法、膠體金免疫層析法等，其中，酶聯免疫法被廣泛應用于三聚氰胺檢測的篩選實驗。本實驗利用酶聯免疫法對生乳進行了三聚氰胺含量的檢測，為摸索三聚氰胺快速有效的檢測方法提供了參考。

圖1 三聚氰胺標準曲線圖

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

酶標儀（北京朗普新技術有限公司）；渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）；生化培養箱（寧波萊福科技有限公司）；微量移液器（瑞寧）；單道計時器；三聚氰胺酶聯免疫試劑盒（北京望爾生物技術有限公司）；乙腈（分析純）。

1.2 工作液配制

1.2.1 復溶工作液

用去離子水將2×濃縮復溶液按1:1體積比稀釋（1份2×濃縮復溶液+1份去離子水），用于樣本的復溶。

1.2.2 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比稀釋（1 份20×濃縮洗滌液+19 份去離子水），用于酶標板的洗滌。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

（1）取出生乳樣品（編號1～25），待其至室溫（25±2 ℃）后，搖勻。分別取400 μL生乳于離心管中，加入800 μL乙腈，渦動1 min。取100 μL上清液，再加入500 μL復溶工作液，混勻，取50 μL進行檢測。

（2）另取3 份空白生乳樣品（經實驗室液相檢測及氣質聯用確證后三聚氰胺含量為0的樣品）400 μL，分別向其中加入10 μg/mL的三聚氰胺標準品0、20和50 μL，分別作為空白對照和2 個陽性添加（0.5、1.25 μg/mL）組，加入800 μL乙腈，渦動1 min。取100 μL上清液，再加入500 μL復溶工作液，混勻，取50 μL進行檢測。

1.3.2 檢測

（1）將所需試劑拿出，置于室溫（25±2 ℃）平衡30 min以上。取出實驗所需酶標板條，插入酶標板架上，未使用的酶標板條用自封袋密封后，立即保存于2～8 ℃的環境中。

（2）編號：將樣品和標準品對應酶標板孔按序編號，每個樣品和標準品做2 個平行孔，并記錄標準孔和樣品孔所在的位置。

（3）將50 μL各標準品工作液（樣品溶液）分別加入對應的微孔中，每個孔中再加入50 μL酶標二抗工作液，最后加入50 μL抗體工作液，輕輕震蕩混勻。蓋好蓋板膜置于25 ℃培養箱中，避光反應30 min。

（4）洗板：揭開蓋板膜，甩干孔中液體，用洗滌工作液250 μL/孔，充分洗滌4～5 次，每次間隔10 s，將酶標板倒置于吸水紙上，拍干。

（5）顯色：加入底物A液50 μL/孔，再加底物B液50 μL/孔，輕輕震蕩混勻，蓋好蓋板膜置于25 ℃培養箱中，避光反應15 min。

（6）測定：揭開蓋板膜，在每個孔中加入50 μL終止液，輕輕震蕩混勻。用酶標儀在雙波長450 nm、630 nm下檢測吸光度值，結果在終止后5 min內讀取。

表1 三聚氰胺標準曲線檢測結果

表2 樣品檢測結果

表3 空白對照及陽性添加樣品回收率測定結果

1.3.3 計算

（1）百分吸光率的計算

各標準品（樣品）的平均吸光度值除以零標平均吸光度值，再乘以100%，可以得到各標準品（樣品）對應的百分吸光率。公式如下：

百分吸光率（%）=（標準品的平均吸光度值/零標的平均吸光度值）×100%

（2）標準曲線繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以三聚氰胺標準品濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品所對應的濃度，乘以其相對應的稀釋倍數，即得到樣品中三聚氰胺的實際濃度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

所測得的標準品吸光度值及百分吸光率如表1所示。按上述方法計算，繪制成三聚氰胺標準曲線，如圖1所示。同一組標準品吸光度值的離散系數均小于3%，說明本實驗的重復性較好，符合試劑盒規定，而且各標準品與曲線的變異偏差小于0.4%，可見此標準曲線的準確率較高，依此曲線所測結果準確可靠。

2.2 樣品及回收率測定結果

依據標準曲線可測得樣品中三聚氰胺含量，空白對照結果及陽性添加樣品回收率如表2、3所示。

從以上兩表的結果顯示，同一組樣品的吸光度值的離散系數均小于10%，說明重復性很好。用陰性奶樣作為陰性空白對照，并用不同濃度的三聚氰胺添加，作為陽性添加回收率的測定，實驗結果如表3所示。空白對照組所得三聚氰胺含量為零，而2 個陽性添加樣品所得平均回收率為97.7%，結果也比較理想，說明此實驗的前處理方法及操作過程可信度較高，所得樣品的結果準確可靠。根據標準規定：嬰兒配方奶粉中三聚氰胺含量不能超過1 mg/kg，而其它食品或動物飼料中的三聚氰胺含量不能超過2.5 mg/kg。當三聚氰胺含量高于2.5 mg/kg即判定為陽性，表2中所示的26 個生乳樣品中，三聚氰胺濃度均未超過68 μg/mL，其中20 號樣品所測吸光度值高出零標吸光度值，出現超陰性現象，可能與奶牛的品種及體質不同有關。所測樣品均符合國家規定，說明相關部門加大了對生乳環節的監管力度，使得違法添加現象大大減少。

3 討論

3.1 以上實驗結果表明，使用酶聯免疫吸附法進行生乳中三聚氰胺含量的檢測，具有快速、簡便、準確、靈敏度高等特點。當檢測量較大時，可以用酶聯免疫吸附法先進行篩選，然后再用其它方法加以確證，這樣可以大大節省時間和工作量，也有利于降低檢測成本。

3.2 在整個實驗中，溫度對實驗結果的影響相當大。實驗前應將樣品及試劑盒充分的溫度控制在室溫25 ℃，實驗中溫度保持在室溫，所有孵育要在25 ℃恒溫箱中進行，而且要避免光線照射，用蓋板膜封好微孔板。

3.3 為避免交叉污染，在吸取不同試劑及樣品時需要更換吸頭。

3.4 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是測定程序中的要點。洗板過程中應避免出現板孔干燥的現象，排干后應立即進行下一步操作，以防曲線不成線性、重復性不好的現象出現。

3.5 試劑盒應保存于2～8 ℃，光線無法直射的環境中，使用后，應立即將所有試劑放回儲存環境下。不要使用過期的試劑盒及試劑，不同批次的試劑盒不能交叉使用，否則會影響結果的靈敏度及準確性。

[1]薛樹科，宋金鳳，時麗艷，等. 乳制品中三聚氰胺檢測研究進展. 河北化工，2010，33（9）：21-23.

[2]黃義彬，鄭麗，歐翔，等. 高效液相法測定雞蛋中三聚氰胺的殘留量. 貴州農業科學，2009，37（6）：221-223.