TCRVβ7.1重組腺病毒載體的構建

【摘要】 將TCRVβ7.1基因克隆入腺病毒穿梭質粒pDC315中，再穿梭質粒和腺病毒骨架質粒共轉染HEK293細胞，包裝出重組腺病毒。然后用PCR，RT-PCR對其進行鑒定。

【關鍵詞】 TCR；重組腺病毒載體；TCRVβ7.1

能夠特異識別抗原肽-MHC復合物的T 細胞受體(T cell antigen receptor ，TCR)，在腫瘤抗原的識別及殺傷過程中具有重要作用[1，2]，將腫瘤抗原特異性識別的TCR基因轉染T細胞用于殺傷腫瘤細胞，是腫瘤免疫治療的方法之一[3]。在以往實驗中發現轉染TCRVβ7.1基因的T細胞對肝癌細胞株BEL-7402[4]殺傷活性明顯提高，由于脂質體的轉染率較低和毒性較大，現構建重組腺病毒載體Ad.TCRVβ7.1，以提高轉染率和降低毒性。

1材料與方法

1.1質粒、菌株和細胞

AdMaxTM 腺病毒包裝系統(腺病毒骨架質粒、腺病毒穿梭質粒pDC315、HEK293細胞)購自加拿大Microbix公司；PBMC從人血分離；質粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宮頸癌細胞）及大腸桿菌E.coli DH5α由本室保存。

1.2試劑

限制性內切酶、T4DNA連接酶、反轉錄試劑盒及DNA Mark購自Takara公司。Lipofectamine2000和Trizol購自Invetrogen公司。質粒提取及膠回收試劑盒均購自Omega公司。淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司。

1.3穿梭質粒pDC315 - Vβ7.1的構建

穿梭質粒pDC315 - Vβ7.1構建過程如（圖1）。設計一對帶有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR產物雙酶切后連接到穿梭質粒pDC315中，得到腺病毒穿梭質粒pDC315 - Vβ7.1。

圖1 穿梭質粒pDC315Vβ7.1的構建

1.4重組腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包裝

接種4×105個低代的HEK293細胞于六孔板中，約24h后細胞密度達到60%～80%時，用脂質體Lipofectamine2000將穿梭質粒和骨架質粒共轉染293細胞。待細胞長滿培養板時，將其消化轉移至10cm細胞培養皿中繼續培養。約細胞轉染10～14d時，可觀察到病毒病變斑出現。繼續培養1到2天使病變斑擴大，1000g離心5min收集細胞，將細胞于-80℃和37℃反復凍融3次后，1000g離心10min，上清即為初次收獲的病毒液。

1.5重組腺病毒AdTCRVβ7.1的鑒定

用病毒核酸提取試劑盒抽提收獲病毒基因組DNA，PCR檢測，鑒定重組病毒是否含有目的基因。用收獲的病毒液感染Hela細胞，抽提細胞總RNA，RT-PCR檢測目的基因是否表達。

2結果

2.1重組腺病毒Ad.TCRVβ7.1的PCR鑒定

用脂質體Lipofectamine2000將構建好的穿梭質粒和骨架質粒共轉染HEK293細胞，待細胞病變后，離心收獲病毒上清。用病毒核酸提取試劑盒提取上清中病毒基因組DNA，用構建時所用的引物做PCR，瓊脂糖電泳檢測可見條帶942bp，與 TCRV β7.1基因相符（圖2）。

圖2 重組腺病毒AD.TCRVβ7.1的PCR鑒定

M:DL2000 DNA markA:TCRVβ7.1PCR 擴增產物

2.2重組腺病毒Ad.TCR Vβ7.1的RT-PCR鑒定

用重組腺病毒Ad.Vβ7.1感染HELA細胞后，48小時提取總RNA，用構建時所用的引物做RT-PCR，可檢測到目的基因TCRVβ7.1的表達（圖3）。

圖3 重組腺病毒AD.Vβ7.1的RT-PCR鑒定

M:DL2000DNAmarker A:TCRVβ7.1RT-PCR 擴增產物

討論

將識別腫瘤特異性抗原的TCRVβ7.1基因[4]轉入健康人外周血淋巴細胞，再將產生抗腫瘤效應細胞毒T細胞（Cytolytic T Lymphocyte，CTL）回輸給患者，其屬于過繼免疫治療[5-6]。由于目前主要采用脂質體作為轉染途徑，較低的轉染率已經成為限制其發展的瓶頸。為了解決這個問題選用了腺病毒載體，它具有以下優點：插入DNA 鏈較長；病毒滴度高；對細胞的感染率高；宿主范圍廣，安全性高，其已成為目前基因免疫治療最常用的載體。成功的構建了重組腺病毒Ad.TVβ7.1，獲得了較高的滴度，為后續的研究奠定了堅實的基礎。

參考文獻(References)

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