同時測定血清中4種電解質的流動注射微電極串聯電化學自動分析系統

摘 要 基于流動注射-微電極串聯的動態電化學技術，建立了能快速、自動、同時測定血清中K＋， Na＋， Cl－和Ca2＋的分析方法和系統，并成功用于血清樣品的測定。為穩定4種電極的基線電位、加快電極響應速度，優化了載流的組分：23 mmol/L Na2B4O7-H3BO3 (pH 7.40)， 0.25 mmol/L K＋， 48.6 mmol/L Na＋， 2.5 mmol/L Cl－和0.25 mmol/L Ca2＋的混合液，流量為1.56 mL/min；混合盤管長度為30 cm （I.D.0.5 mm）。本方法的測定范圍分別是2.0～22.0 mmol/L K＋， 90～253 mmol/L Na＋， 20～248 mmol/L Cl－， 0.35～10.0 mmol/L Ca2＋，相對標準偏差小于1.05% (n＝11)，回收率為96.7%～103.7%，分析速度為120樣/h，每次測定的樣品耗量僅為45

SymbolmA@ L。本系統采用載流連續流動和微量樣品注入，實現了系統的自動清洗，解決了樣品交叉污染、流通式電極敏感膜表面血清纖維蛋白吸附及堵塞等問題，延長了使用壽命。

關鍵詞 流動注射， 流通式微電極， 血清， 鉀， 鈉， 氯， 鈣， 同時測定

2010-10-18收稿；2010-12-20接受

本文系四川大學214人才引進振興計劃基金 (No. 0082204127067) 資助項目

 E-mail：lysgxf2005@yahoo.com.cn

1 引 言

正常人血清中分別含有3.5～5.4 mmol/L K＋， 135～145 mmol/L Na＋， 96～110 mmol/L Cl－和1.15～1.35 mmol/L Ca2＋的電解質［1］。這些電解質對保持體液酸堿平衡、維持滲透壓起重要作用。當人體發生病變時，如糖尿病、酸中毒、腎衰竭、嚴重嘔吐、腹瀉、滲出性胸膜炎或腹膜炎等，會引起電解質濃度偏離正常范圍。因此，及時測定病人體液中的電解質濃度，對診斷這些疾病具有重大意義。

目前，測定電解質濃度的方法有火焰光度法［2］、原子吸收法［3，4］、離子選擇性電極法(Ion-selective electrode， ISE)［5，6］等，但是這些方法不能用于血清中K＋， Na＋， Cl－和Ca2＋的同時測定。雖然基于ISE法的電解質分析儀(Electrolyte analyzer， EA)［7］實現了同時測定上述4種離子［8］，但該系統是以電極響應平衡為基礎，分析速度較慢；另外，為了獲得穩定的電位信號及準確的測定結果，血清樣品需長時間滯留在EA系統內，導致系統污染；而且，由于血清樣品中的纖維蛋白易吸附在流通式電極敏感膜上［9，10］，導致電極膜很快老化［11，12］，靈敏度急劇降低［13］，最終縮短了流通式電極的壽命。EA系統存在樣品交叉污染嚴重、無法精確控制進樣量、檢測步驟繁瑣、儀器成本高、可靠性差等缺點。

流動注射分析(Flow injection analysis， FIA)具有分析速度快、樣品用量少、精度高等優點［14～18］。本研究將FIA與ISE結合，建立了FIA-流通微電極串聯電化學自動分析方法和系統（Flow-injection mini-electrode electrochemical analysis， FI-ME-ECA），利用此系統同時測定了血清中K＋， Na＋， Cl－和Ca2＋的含量。與傳統的電解質分析系統相比，本系統的特點是：載流連續流經微電極敏感膜，能始終保持整個流路清潔，避免了敏感膜表面干-濕變化對其穩定性和靈敏性的影響；被測樣品以“樣品塞”形式注入系統，不在流通式微電極內停留，解決了血清樣品在流路中停留所產生的交叉污染、血清纖維蛋白在電極通道的吸附及堵塞等問題； 顯著降低了樣品耗量，加快了分析速度，延長了流通式電極敏感膜的使用壽命。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FIA-3110流動注射儀(北京吉天儀器有限公司）； AUW120D型電子天平(日本島津公司）； 艾柯KL-UP-IV-10型超純水器(成都康寧實驗專用純水設備廠）； pH-Meter HM-7B(日本東亞電波株式會社)； 微型流通式管狀電極（鄭州匯科電子有限公司）； K， Na， Ca和Cl流通式檢測器（自制）； 多通道電位信號同時處理軟件（自編程序）。

NaCl， KCl， Na2B4O7， H3BO3， NaNO3， BaCl2， MnCl2#8226;4H2O， FeCl3#8226;6H2O， ZnCl2， C6H12O6， NaHCO3， Na2HPO4， Na2SO4， NaAc， 三羥甲基氨基甲烷（Tris）及牛血清白蛋白(BSA) 購于成都科龍化工試劑廠； CaCl2#8226;2H2O（天津化工試劑廠）； NaNO2(重慶北碚化學試劑廠)； NaF， Cr(NO3)3#8226;9H2O(成都化學試劑廠)； SrCl2#8226;6H2O (成都醫藥試劑廠)； CoCl2#8226;6H2O (重慶化學試劑廠)； Cu(NO3)2#8226;3H2O(廣東西隴化學試劑廠)。所用試劑均為分析純。實驗用水為超純水(電導率為0.065

SymbolmA@ S／cm)。

混合標準液含有NaCl， KCl， CaCl2#8226;2H2O及Na2B4O7-H3BO3緩沖液。Cl－同時由KCl， CaCl2及NaCl提供，Na＋同時由NaCl和Na2B4O7提供。

2.2 實驗方法

同時測定血清中K＋， Na＋， Ca2＋和Cl－的系統如圖1所示。系統由蠕動泵(P)、注入閥(V)、混合盤管(MC)、K＋， Na＋， Ca2＋， Cl－流通式檢測器(4-MFE-D)、多通道電位信號同時處理軟件(MSPS)組成。 圖1 同時測定血清中K， Na， Cl， Ca的流動注射離子選擇電極系統

Fig．1 Flow injection analysis manifold for simultaneously determining K＋， Na＋， Cl－， Ca2＋ in serums based on flow-through ion-selective electrodes

V: 注入閥(Injection valve); SL: 采樣環(Sampling loop)；4-MFE-D: K＋， Na＋， Ca2＋， Cl－微型流通電極檢測器(Flow-through type K＋， Na＋， Ca2＋， Cl－ electrodes); MSPS:多通道信號處理軟件(Computer soft system for treating multi-channel signals)。

在蠕動泵P2的推動下，載流連續流過注入閥(V)、混合盤管和4-MFE-D，產生4種穩定的基線電極電位(ΔErefb＝Eib－Erefb，Eib和Erefb分別為指示電極和參比電極對載流的響應電位)，由MSPS記錄。注入閥處于“采樣位置”時，在蠕動泵P1的抽吸作用下，被測樣品進入采樣環進行采樣和定量分析，多余樣品由排廢口1排出；當注入閥自動切換到“注入位置”時，采樣環中的“樣品塞”被注入載流中，隨后被推入混合盤管和4-MFE-D中， 并與各個流通式微電極敏感膜表面接觸，發生電化學反應，4個電極分別給出各自的電位信號 (ΔErefs＝Eis－Erefs，Eis和Erefs分別為指示電極和參比電極對樣品塞的響應電位)；“樣品塞”最后從廢液口2排出；重復上述過程，注入閥再次自動切換到“采樣位置”。4個電極輸出的信號經MSPS軟件處理。

第6期周 磊等： 同時測定血清中4種電解質的流動注射微電極串聯電化學自動分析系統

3 結果與討論

3.1 測定原理

與傳統電化學分析法不同，FI-ME-ECA法的被測樣品始終處于物理分散、電化學響應的動態非平衡狀態［19］，能使標準液和試樣液在電極敏感膜表面高度重現地發生電化學反應，并按照能斯特方程使離子濃度（C）與電極響應值(ΔE)呈對數線性關系，ΔE＝E0＋(2.303RT/nF)lgC， E0為標準電極電勢(mV)，R為氣體常數（8.314 J/(K mol）)，T為絕對溫度(K)，n為離子電荷，F為法拉第常數（96485 C/mol）。由于血清中電解質濃度的變化范圍很窄，其濃度與ΔE之間的相關性可簡化成一次線性方程關系ΔE＝b＋KC， K為電極響應斜率(mV L mmol－1，b為電極響應空白電位(mV)。在FI-ME-ECA系統中，采用一次線性方程同時測定血清中K＋， Na＋， Cl－和Ca2＋的濃度。

3.2 分析系統工作參數的優化

3.2.1 采樣體積的影響 采用6個混合標準樣品(No.1～6)作為測試樣品，考察進樣體積(Sv，45～330

SymbolmA@ L)對靈敏度的影響。No.1～6混合標準樣品中分別含1.00， 3.50， 3.88， 4.75， 5.50和6.00 mmol/L K＋；649， 129.9， 135.6， 139.7， 148.7和157.7 mmol/L Na＋；20.3， 90.2， 94.8， 99.9， 110.0和119.7 mmol/L Cl－： 059， 1.03， 1.11， 1.19， 1.35和1.39 mmol/L Ca2＋。以No.1混合標準為載流；流量1.56 mL/min。實驗表明，隨著Sv增加，4個電極的靈敏度(mV L mmol－1)均增大(K＋：2.68→4.55；Na＋：0.06→0.14；Cl－：－0.12→－0.21；Ca2＋：3.59→5.63)，電極的ΔE與電解質濃度之間呈現良好的線性相關。但從實測曲線可知，Sv增加會使響應信號返回基線的時間增加，導致分析速度降低。綜合考慮，本系統的進樣體積選定為45

SymbolmA@ L，對應的分析速度為120樣/h。 此分析速度遠大于傳統的電化學分析法。

3.2.2 載流流量的影響 在上述條件下，考察載流流量(0.54～2.98 mL/min)對靈敏度的影響。實驗表明，隨著載流流量增加，4種電極的靈敏度(mV L mmol－1)均降低(K＋：3.75→2.28；Na＋：0.13→0.05；Cl－：－0.21→－0.15；Ca2＋：5.21→3.53)。但根據記錄曲線可知，隨著載流流量增加，響應信號返回基線的時間縮短，導致進樣頻率加快。綜合考慮，載流流量選定為1.56 mL/min。

3.2.3 混合盤管長度的影響 在上述最佳條件下，考察混合盤管長度(8.5～120 cm)對4種電極響應電位的影響。當混合盤管長度在8.5～60 cm范圍內變化時，4個電極的靈敏度(mV L mmol－1)基本不變(K＋：2.77±0.17; Na＋：0.14±0.02; Cl－： －0.29±0.02; Ca2＋：11.07±0.51)，電極的ΔE與電解質濃度之間呈現良好的線性相關；繼續增加混合盤管長度至120 cm時，4個電極的靈敏度(mV L mmol－1)分別降低到2.06(K＋)， 0.10(Na＋)， －0.26(Cl－)， 7.05(Ca2＋)。其原因是，混合盤管長度的增加，使“樣品塞”在載流中的分散度增大，樣品被載流稀釋的程度增大，導致ΔE值和靈敏度降低。但混合盤管長度太短時，載流與樣品混合不均勻，影響載流對樣品中離子強度及酸度的調節作用。綜合考慮，混合盤管長度選擇30 cm。

3.2.4 緩沖溶液種類及濃度的影響 在選擇FI-ME-ECA系統中的緩沖液組分時，考慮到某些陰離子可能與被測Ca2＋形成沉淀， 或與Cl－電極發生電化學反應，產生干擾。所以，本研究選擇臨床檢驗中常用的Tris-H3BO3 (TBBS)和H3BO3-Na2B4O7 (BBS)兩種緩沖液，進行了適用性考察。選上述最佳條件，考察了緩沖液對電極響應電位的影響。結果表明：使用TBBS緩沖液時電極的靈敏度(mV L mmol－1)分別為1.99 (K＋)， 0.13 (Na＋)， －0.23 (Cl－)和9.18 (Ca2＋)； 使用BBS緩沖液時電極的靈敏度(mV L mmol－1)分別為2.07 (K＋)， 0.14 (Na＋)， －0.27 (Cl－)和10.78 (Ca2＋)。4種電極的靈敏度均高于TBBS緩沖液。因此，選擇BBS作為FI-ME-ECA系統的緩沖液。

考察了BBS中B4O2－7濃度(5～30 mmol/L)對4種電極響應電位的影響。結果表明，隨著混合標準溶液中B4O2－7濃度的增加，4種電極電位響應靈敏度(mV L mmol－1)均增大(K＋：1.84→2.39；Na＋：0.07→0.10；Cl－：－0.06→－0.22；Ca2＋：5.51→7.63)。但是，再繼續增加B4O2－7(Na2B4O7)濃度，會導致混合標準溶液中Na＋濃度增大。如果保持混合標準溶液中Na＋濃度不變，只能通過減少NaCl添加量來實現。但這樣會導致Cl－濃度偏離正常血清中Cl－的含量范圍，所以不能通過增大B4O2－7濃度增大電極的響應。因此，將B4O2－7濃度選為23 mmol/L。

3.2.5 酸度對4種電極響應電位的影響

以No.1混合標準溶液為載流、No.2和No.4混合標準溶液為測試樣品，考察了酸度對4種電極響應電位的影響。結果表明，在pH 6.00～9.00范圍內，ΔE2（K）和ΔE4（K）分別為（7.64±0.22） mV和 （9.19±0.19） mV，ΔE2（Na）和ΔE4（Na）分別為（7.75±0.19） mV 和（9.99±0.27） mV，ΔE2（Cl）和ΔE4（Cl）分別為（－29.19±1.06） mV 和（－33.13±1.78） mV；ΔE2（Ca）和ΔE4（Ca）分別為（7.67±0.19） mV 和（9.67±0.40） mV。由此可見，混合標準溶液的酸度雖不同，但對應的電極響應電位基本不變，說明酸度對電極響應影響不大。由于本系統主要用于血清樣品的測定，而正常血清樣品的酸度范圍在pH 7.35～7.45，所以，混合標準溶液的酸度選擇為pH 7.40。

3.2.6 載流中待測離子濃度對電極響應的影響 改變載流中K＋， Na＋， Cl－和Ca2＋的濃度，考察它們對電極響應的影響。結果表明，載流中K＋， Na＋， Cl－和Ca2＋含量分別為0.25， 48.6， 2.5和0.25 mmol/L時，4種電極靈敏度(mV L mmol－1)都達到最大 (K＋：2.29； Na＋：0.12；Cl－：－0.28；Ca2＋：12.25)；繼續增加載流中4種離子的含量，其離子電極的靈敏度開始降低。這是由于增加載流中待測離子濃度將導致基線電位的絕對值(ΔErefb＝Eib－Erefb)增大，使“樣品塞”產生的電極響應相對值(ΔEbs＝ΔErefs－ΔErefb)變小，表面上顯現的是電極靈敏度變低。所以，載流中添加的K＋， Na＋， Cl－和Ca2＋的含量選擇為0.25， 48.6， 25和0.25 mmol/L。

3.3 血清中共存離子對4種電極響應電位的影響

在選定的實驗條件下，測定No.4混合標準溶液的ΔE4值，在其中分別添加血清中常見的各種共存離子，再分別測定其ΔE4′值，計算回收率。結果表明，血清中正常濃度范圍內的NO－2， NO－3， F－， Ba2＋， Sr2＋， Cr3＋， Co2＋， Mn2＋， Mg2＋， Fe3＋， Zn2＋， NH＋4， Cu2＋， HCO－3， SO2－4， Ac－， HPO2－4及C6H12O6均不干擾K＋， Na＋， Cl－和Ca2＋的同時測定，而其蛋白質（以BSA計）不干擾K＋， Na＋和Cl－的測定，但干擾Ca2＋的測定。這是由于加入的BSA與Ca2＋絡合，降低了Ca2＋的游離濃度，導致Ca2＋電極響應電位降低，而在血清中蛋白已與40%的總Ca2＋絡合并達到平衡［1］，所以血清樣品中的蛋白對游離Ca2＋的測定不產生干擾。

3.4 校準曲線線性范圍及重現性的考察

在優選的實驗條件下，考察了FI-ME-ECA系統的線性響應范圍，結果見表1。4種離子濃度在血清正常范圍內，FI-ME-ECA系統的響應信號線性良好。另外，分別用No.2和No.4混合標準溶液作為樣品進行FIA系統的重現性實驗(n＝11)，得到響應電位和相對標準偏差(RSD)，結果見表1。可以看出，本系統的穩定性和精密度很好。

3.5 血清樣品及回收率的測定

3.5.1 血清樣品測定 采用本系統測定了3個實際血清樣品，根據表1中4種離子的回歸線性方程求出其含量，結果見表2。由于在電極響應曲線的較窄范圍內，可視為簡單的一次線性相關，所以表2中3個實際血清樣品的電解質數據是根據一次線性方程計算獲得的。為了考察計算結果的可靠性，用對數方程計算了3個血清樣品中各種電解質濃度。可以看出，兩種方程的結果一致。

3.5.2 回收率的測定 為了考察上述測

 根據對數方程得到的結果（Results obtained from logarithm equation）: ΔE＝27.89lgC (K＋)＋5.69；ΔE＝38.01 lgC (Na＋)－66.40；ΔE＝－28.57 lgC (Cl－)＋29.88；ΔE＝26.43lgC (Ca2＋)＋14.11)。

定結果的準確性，進行了血清樣品添加標準離子的回收率實驗。由于血清中添加被測離子標準液后，會導致電極響應電位超出上述的一次線性方程范圍(ΔE＝KC＋b)，變成對數響應(ΔE＝KlgC＋b)。所以，先考察了本方法的對數線性范圍。結果表明，4個電極的對數線性響應范圍分別是：2.0～22 mmol/L(K＋)， 90～253 mmol/L (Na＋)， 20～248 mmol/L (Cl－)和0.35～10 mmol/L (Ca2＋)，而且線性良好，可用于血清回收率的計算。以No.1血樣為測試樣品(600

SymbolmA@ L)，分別添加不同濃度的混合標準溶液(30

SymbolmA@ L)，用FI-ME-ECA系統測定其回收率，結果見表3。K＋， Na＋， Ca2＋和Cl－的添加回收率為96.7%～103.7%。表明本系統精度高、分析速度快、自動化程度高，具有發展前景和應用價值。

致 謝 感謝深圳大學的張會生為本課題提供了流通式離子選擇電極檢測器，感謝盧岳軍在多通道信號處理軟件編制方面的支持。

References

1 ZHU Zhong-Yong(朱忠勇). Practical Medical Laboratory Science (實用醫學檢驗學). Beijing (北京): People′s Military Medical Press(人民軍醫出版社)， 1998: 276～281

2 Doku G N， Gadzekpo V P Y. Talanta， 1996， 43(5): 735～739

3 Viitak A， Volynsky A B. Talanta， 2006， 70(4): 890～895

4 Lopes C M P V， Almeido A A， Santos J L M， Lima J L F C. Anal. Chim. Acta， 2006， 555(2): 370～376

5 Ayranci E， Duman O. Food Chem.， 2004， 84(4): 539～543

6 Malon A，Magdalena M Z. Sensors and Actuators B， 2005， 108(1-2): 828～831

7 Luthe H， Domke I， Jung M. Clin. Chem.， 2007， 53(6): A95～A96

8 Marit S S， Tore W L， Bjorn B J. Clin. Chem.， 2010， 56(8): 1329～1335

9 Dimeski G， Badrick T， John A S. Clin. Chim. Acta， 2010， 411(5-6): 309～317

10 Rumenjak V， Milardovic S， Kruhak I. Clin. Chim. Acta， 2003， 335(1-2): 75～81

11 Hristova E N， Cecco S， Niemeia J E. Clin. Chem.， 1995， 41(11): 1649～1653

12 Vrouwe E X， Luttge R， Vermes I. Clin. Chem.， 2007， 53(1): 117～123

13 Rumenjak V， Kruhak I， Milardovic S.Lab. Robot Autom.， 1998， 10(4): 205～213

14 LI Yong-Sheng， GAO Xiu-Feng(李永生，高秀峰). Foreign Medic. Sciences-section of Clini. Biochem. and Lab. Medic.(國外醫學臨床生物化手與檢驗學分冊)， 1989， 10(5): 21～24

15 SHI Xin， WANG Jie， LIU Zhong-Ming（石 鑫， 王 捷， 劉仲明）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學），2010， 38（9）： 1377～1380

16 LI Yong-Sheng，GAO Xiu-Feng. Flow Injection Analysis and Application for Chemistry Analysis. Changchun: The Jilin People′s Publisher， 2002: 2～15

17 ZHONG Hong-Sheng， LI Yong-Sheng， ZHANG Hong， ZHANG Shu-Juan(鐘紅生，李永生，張 紅，張淑娟). Chinese J. Anal.Chem.(分析化學)， 2010， 38(11): 1629～1633

18 LI Yong-Sheng， GUO Hui(李永生，郭 慧). Chinese J. Anal.Chem.(分析化學)， 2008， 36(6): 805～810

19 LI Yong-Sheng， TIAN Jian-Feng， WAN Rui-Jun(李永生，田建鋒，萬瑞軍). Anal. Instrum.(分析儀器)， 2004， (1): 1～5

An Automatic Flow-injection Micro-electrode Electrochemical

Analysis System for Simultaneous Determination of

Four Kinds of Serum Electrolytes

ZHOU Lei1， LAI Zhen-Yao1， ZHANG Hui-Sheng3， GAO Xiu-Feng2， LI Yong-Sheng1

1 (School of Chemical Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065)

2(West China School of Preclinical and Forensic Medicine， Sichuan University， Chengdu 610041)

3(School of Information Technology， Shenzhen University， Shenzhen 518060)

Abstract A new automatic analysis method and system for simultaneous determination of K＋， Na＋， Cl－ and Ca2＋ in serum was proposed on the basis of flow-injection micro-electrode dynamic electrochemical technology (FI-ME-ECA). To stabilize baseline

potentials of four electrodes and to accelerate response of the electrodes， we have examined various components in the carrier of the FI-ME-ECA and optimized experimental conditions. Obtained results were as follows: 23 mmol/L of Na2B4O7-H3BO3 (pH 7.40) was used as the buffer solution， the carrier solution are consist of 0.25 mmol/L K＋， 48.6 mmol/L Na＋， 2.5 mmol/L Cl－ and 0.25 mmol/L Ca2＋， and its flow rate is selected 1.56 mL/min. The length of mixing coil was 30 cm (I.D. 0.5 mm). The linear determination ranges of the method are 3.0－6.0 mmol/L for K＋， 90－253 mmol/L for Na＋， 20－248 mmol/L for Cl－ and 0.35－10 mmol/L for Ca2＋， respectively， the relative standard deviation (RSD) is less than 1.1%(n＝11)， the recoveries obtained by adding K＋， Na＋， Cl－ and Ca2＋ in serum samples are in range of 96.7%－103.7%， analysis speed of the system is 120 samples/h (480 detections/h)， consumption of the sample is only 45

SymbolmA@ L at a time. Main merits of the FI-ME-ECA are injection of micro-volume sample and continuous flow of the carrier solution. It has achieved automatic cleaning of the FIA manifold， and has avoided carryover between the samples， and has removed sorption and stemming of fibrin on the sensor channels， and has prolonged life of the electrodes.

Keywords Flow-injection analysis; Flow-through type micro-electrode; Serum; Potassium; Sodium; Calcium; Chloride; Simultaneous determination

(Received 18 October 2010; accepted 20 December 2010)