核酸適體技術在食品安全分析中的應用

摘 要 核酸適體（Aptamer）是經體外篩選技術（SELEX）篩選出的能特異結合蛋白質或其它小分子物質的寡聚核苷酸片段，對可結合的配體有嚴格的識別能力和高度的親和力。經過十幾年的發展，SELEX技術已經成為一種重要的研究手段和工具，被廣泛應用到分子生物學、基因組學、臨床醫學等領域。高通量篩選的技術特點與Aptamer精確識別、易體外合成與修飾等特性，使得Aptamer在分析化學與生物醫藥研究方面具有廣闊的應用前景。本文對提高篩選效率和效果為目標的核酸適體篩選技術新進展、核酸適體技術在食品安全分析中的應用進行了回顧，展望了核酸適體在食品安全分析上的應用前景。

關鍵詞 核酸適體； 指數富集配體系統進化； 食品安全； 殘留分析;有機小分子，評述

2010-12-26收稿；2011-03-20接受

本文系廈門市科技計劃項目（No.3502Z20092008）；福建省自然科學基金項目（No.2008J0107）；國家質檢總局科技計劃項目（No.2010IK150）；國家重點基礎研究發展計劃（973）項目（No.2010CB732400）資助

* E-mail:Zhouy@xmciq.gov.cn;Xudm@xmciq.gov.cn

1 引 言

1953年，DNA雙螺旋結構的提出，是現代分子生物學誕生的里程碑［1，2］。自此對于核酸生物大分子的研究進入了一個嶄新的時代。1990年，兩個獨立的研究團隊分別在《Nature》［3］和《Science》［4］上發表有關體外篩選特定靶物質結合性核酸的研究論文，并命名此種核酸為Aptamer，它由拉丁語aptus（意為“匹配”）和希臘語詞綴meros組成，中文譯為“適體”、“適配子“或“核酸適體”。核酸適體的篩選技術被稱為“配體指數富集系統進化”（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX）［4］，它是以組合化學技術、PCR技術以及基因克隆測序技術等為基礎的整合技術。隨著近年來現代分子生物學技術的快速發展，SELEX技術也不斷創新，出現了許多具有不同應用目的的核酸適體篩選方法［5， 6］。這些方法極大地促進了核酸適體科學的快速發展。經歷了20年，核酸適體科學日漸成熟，在生物學和醫學中的應用已受到廣泛關注，如分子識別［7，8］、藥物篩選［7，8］、靶點鑒定［8，9］、基因表達調控［9］、醫學成像［9］、臨床診斷［9，10］及疾病治療［10］等。不僅如此，核酸適體作為一種靶物質結合分子，在分析科學領域也展現出巨大的應用潛力，特別是在小分子化物的分離分析中具有其獨特的應用優勢。

食品安全問題在21世紀已經成為全世界關注的重大問題，對消費者的身體健康產生了重大的影響。由于食品種類豐富，食品中檢測的有毒有害物質種類和組分繁多，需要檢測的物質質量極低，樣品中待檢物的濃度通常為

SymbolmA@ g和ng級，甚至pg 級。除此之外，許多檢測物除需檢測物質本身，還涉及其衍生物和降解物測定。因此食品檢測要求檢測方法更加準確、快速、方便。核酸適體具有靶分子廣、特異性強、靈敏度高、檢測成本低、安全可靠等優點，在食品安全檢測中有著良好的應用前景。本文對SELEX技術原理、核酸適體篩選技術及在食品安全分析中的應用進展進行了綜述。

2 SELEX技術的基本原理

SELEX技術的總體思路是從通過組合化學原理設計合成的隨機寡核苷酸庫（約1015～1018 種核酸分子）中， 經多輪篩選和指數富集， 最終獲得目標核酸適體［11］。作為核酸適體的篩選技術，SELEX過程起始于組合化學合成的隨機寡核苷酸庫（RNA或DNA）。庫中核酸分子的結構特點是：兩端為固定序列，中間為隨機序列。隨機序列（區）賦予每個核酸分子不同的空間結構，決定著隨機寡核苷酸庫的庫容量及多樣性。理論上， 如果寡核苷酸中的隨機序列由n個堿基組成，庫容量則為4n。若再考慮人為塑造的修飾文庫，隨機序列的多樣性則更為豐富［6，12］。SELEX技術是分子進化工程技術的一種，技術流程包含了類似于達爾文進化理論的3個過程：自發突變、自然選擇和大量增殖［13］。

SELEX篩選核酸適體的基本過程如圖1所示［6］。主要包括以下幾個步驟［14～16］：（1）運用分子生物學技術，人工設計并合成容量龐大的（1015～1018）單鏈隨機寡核苷酸（DNA或RNA）序列的文庫，

圖1 SELEX基本過程［６］

Fig.1 In vitro selection of target-specific aptamers using systematic evolution of ligants by exponential enrichment （SELEX） technique［６］

其中隨機寡核苷酸序列長度一般在15～60個堿基之間，隨機序列兩端固定在用于PCR擴增及其它酶學反應相關引物的結合位點。隨機文庫在特定緩沖體系下與靶分子溫育；（2）通過特定分離方法如離心法、濾膜法、磁珠法、毛細管電泳法、柱層析等實現與靶分子結合的核酸序列和非結合的核酸序列間的分離；（3）對分離出的結合核酸序列進行反篩選，進一步排除掉非特異性結合的核酸序列；（4）對獲得的特異性結合的核酸序列進行PCR擴增，形成次一級核酸庫，利用生成的次一級核酸庫重復步驟（2）和（3），隨著每一輪篩選條件的不斷提高，與靶目標高度特異結合的DNA或RNA分子呈指數增長。而親和力低的序列逐步被淘汰，直到獲得核酸文庫對靶分子的解離常數達到目標值；（5）對所獲得的核酸序列進行克隆測序，鑒定測定序列與其靶分子結合的特異性和親和力。

第6期徐敦明等： 核酸適體技術在食品安全分析中的應用

3 核酸適體篩選技術

SELEX技術的特點是將分子的進化過程轉移到體外進行，但是在核酸適體的實際篩選中，SELEX往往受到篩選環境及技術本身限制，影響篩選效果和篩選效率。近年來， 研究人員在傳統SELEX基礎上，發展出許多適合不同目的的新型SELEX技術。這些SELEX技術的出現，極大地推動了核酸適體技術在各學科領域中的應用和發展。

3.1 毛細管電泳SELEX（Capillary electrophoresis SELEX， CE-SELEX）

SELEX技術中靶分子結合核酸與游離核酸的分離至關重要，是限制經典SELEX 技術發展的一個難點。Mendonsa和Bowser（2004）根據核酸適體與靶分子結合能夠使其構象和質量改變并導致其電泳行為顯著變化的特性，利用毛細管電泳成功地將上述兩種不同狀態的核酸分子有效分離［17］。毛細管電泳技術（CE）的應用對于提高SELEX的篩選效率具有重要的意義。因為毛細管電泳能快速、高效地從未結合的DNA文庫中分離出靶分子-核酸適體復合物，因此利用CE-SELEX 方法僅需2～4輪篩選就可獲得靶分子的特異核酸適體。Drabovich 等（2005）根據ECEEM（Equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures）的特征，利用不同親和力核酸適體的遷移率差異，收集不同時相的平衡混合物，僅3輪篩選就獲得識別MutS 蛋白的核酸適體［18］。但是CE-SELEX技術的一個主要缺陷是注射進樣體積小（nL級），限制了初始庫DNA的數量，因此與傳統SELEX相比一般只有1013個DNA分子數量的文庫用于篩選。毛細管電泳SELEX 技術的出現，極大地提高了SELEX 篩選效率，縮短了SELEX 篩選過程，將可能成為未來核酸適體篩選的主要手段之一［18］。

3.2 加尾SELEX（Tailored SELEX）

通常人工合成的寡核苷酸序列包含中間的隨機區和兩端15～25 nt已知序列的固定區，固定區雖然方便PCR 擴增與體外轉錄，但常常參與核酸適體與靶分子的結合，影響后續的截短活性序列的功能。另外，固定區還有可能與中間的隨機區退火而影響篩選。Vater等［19］ 建立了加尾SELEX技術，克服了上述缺點，能夠直接、快速獲得與靶分子結合的RNA 序列，而無需進一步的截短實驗。其原理是首先構建隨機文庫，兩端各含有4 和6 nt 的固定序列，用于與接頭序列連接搭橋。合成文庫兩端的單鏈連接序列含有T7 啟動子序列、可堿裂解的堿基以及便于文庫擴增的序列。合成的單鏈接頭序列，能夠與上述連接序列和文庫的固定序列退火，形成搭橋，用于PCR 擴增。如此，篩選過程中僅投入隨機文庫，在篩選后通過連接、搭橋的方式加入兩端連接序列與接頭序列，PCR 擴增后再經堿裂解處理去除兩端序列，投入下一輪篩選。加尾篩選與傳統篩選相比，多了引物連接與PCR擴增后堿裂解除去引物兩個步驟，進入下一輪循環的仍為短固定序列的寡核苷酸庫。加尾篩選能夠篩選出既簡短，親和力又很高的核酸適體，而且可以應用于自動化篩選體系中。

3.3 無引物基因組SELEX（Primer-free genomic SELEX）

1997年，Singer［20］和Gold［21］分別根據SELEX 技術原理將感興趣的生物體基因組制成寡核苷酸文庫，從中篩選生物活性分子（如蛋白質、輔因子、多糖、抗生素等）的天然識別序列。他們建立的Genomic SELEX 為解析細胞內基因調控、代謝調控等問題提供了大量實驗數據［22］。由于基因組SELEX 中用于PCR 擴增的引物序列可能會與中間的基因組序列配對，從而干擾靶標與基因組序列的結合。Wen 等［23］結合加尾SELEX原理，發展出了無引物基因組SELEX（Primer-free genomic SELEX）方法。該方法是在篩選之前先將引物從基因組文庫中除去。文庫與靶分子孵育后，篩選獲得的基因片段通過雜交-延伸熱循環反應加入引物序列進行PCR 擴增。無引物基因組SELEX 為研究基因組調控提供了新的技術平臺。

3.4 消減SELEX（Subtractive SELEX）

2003年，Wang等［24］建立了消減SELEX。消減SELEX的原理是在篩選過程中扣除能與已知或未知的共有靶分子的核酸分子，消減后的次級隨機文庫投入特異靶標的篩選。利用消減SELEX 技術可以從兩組高度同源的靶分子混合物中篩選獲得差異靶分子的特異核酸適體。消減SELEX 技術可在臨床診斷、靶向治療及腫瘤個性化治療中具有其獨特的優勢。

3.5 切換SELEX（Toggling SELEX）

切換SELEX 是應用不同物種的靶標蛋白，篩選產生物種交叉反應性核酸適體。 這是White 等（2001）建立的一種改良SELEX 技術［25］。他們首先應用隨機RNA 文庫篩選人凝血酶和豬凝血酶的混合物，富集的文庫再依次篩選人凝血酶和豬凝血酶，如此經過13 輪篩選，獲得能夠與人凝血酶和豬凝血酶都特異結合的核酸適體［25］。由于臨床藥物研發常常應用人體蛋白為靶標，但在活性檢測中要進行動物模型的實驗，因此這種交叉反應性核酸適體便于在動物模型上進行藥物分子的臨床前評價。另外，對于某一蛋白質而言，物種間保守的結構域常常是該蛋白質發揮功能所必需。切換SELEX 能夠獲得針對該結構域特異的核酸適體，因此能夠提高核酸適體的功能活性。同樣，這種方法也適合篩選同一物種內具有冗余功能或重疊功能的受體家族蛋白，配體家族蛋白或結構相關蛋白靶標。

3.6 表達盒SELEX（Expression cassette SELEX）

將核酸適體用于基因治療時需要將核酸序列轉染哺乳細胞進行體內轉錄， 如將核酸適體插入tRNA 表達盒中轉錄產生嵌合tRNA， 但轉錄的側翼序列常常影響核酸適體的空間結構，進而降低核酸適體的生物活性。Martell 等（2002）針對這一弊端將體外篩選的轉錄因子E2F的核酸適體插入到tRNA中，側翼引入隨機區，然后再用SELEX 流程體外篩選與E2F結合的序列，這樣產生的嵌合RNA 在體內既能表達高水平的核酸適體，又可以維持核酸適體的活性，由此建立的表達盒SELEX，為探討核酸適體的基因治療奠定了基礎［26］。

3.7 熒光磁珠 SELEX（FluMag SELEX）

Bruno（1997）［27］首次應用基于磁珠的親和分離方法篩選到氯代芳烴（Chloroaromatics）的適配子。2003年，Murphy等［28］在篩選甲狀腺轉錄因子I（TrF1）時，將TTF1標記His-6后再用Ni-NTA磁珠固定，能減少篩選到與污染物結合的適配子。2005年，Stoltenburg 等［29］引入熒光標記進行DNA定量和用磁珠固定靶分子便于分離而建立了熒光磁珠法SELEX（FluMag-SELEX）。他們以篩選鏈酶親和素的適配子為例建立了該方法，其基本過程是將鏈酶親和素（作為靶分子）包被磁珠，然后與核酸文庫孵育，分離去除未結合的核酸，洗脫下結合核酸，用熒光標記的引物進行PCR擴增，聚丙烯酰胺電泳，回收正鏈作為下一輪篩選的文庫。由于FluMag-SELEX采用熒光定量，避免了同位素的使用，可直接了解與靶分子結合的核酸量；并且靶分子用量小，減少了商業純化靶蛋白的所需的成本；能快速而高效地分離結合與非結合核酸；操作更為簡單。FluMag- SELEX技術的這些優點表明FluMag-SELEX技術在核酸適體的篩選中有著良好的應用前景。

3.8 自動化SELEX（Automated SELEX）

Cox等 ［30］于1998年基于Beckmann Biomek 2000 Pipetting系統創建了第一個自動化篩選工作站，并成功獲得了溶菌酶的核酸適體。該工作站包括機械操控臺、熱循環儀、磁珠自動分離器、多屏真空過濾儀、酶冷卻儀及自動移液工具等。篩選的流程包括：通過鏈酶親和素與生物素的相互作用，將生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。隨后特異結合序列的分離，RT-PCR 擴增和轉錄都通過設定的程序自動完成，最后篩選得到的序列克隆到載體中進行測序鑒定。通過這種自動化篩選工作臺，Cox等［30］只用了不到兩天的時間就完成了12 輪的篩選。但由于上述自動化篩選需要純化的蛋白質作為靶標，限制了它在蛋白質組學中的應用。對此，Cox 等［31］（2002）又做了進一步改進，直接利用基因體外轉錄與翻譯的方法產生靶蛋白，通過在基因的5′端引入T7 啟動子和一個生物素蛋白連接酶（BPL）識別序列（Biotag），3′端引入BPL 基因及T7 終止子，轉錄產生兩個順式的mRNA， 翻譯后產生BPL 蛋白與一個Biotag 標簽的目的蛋白。當加入游離的生物素時，BPL 識別Biotag 序列，將生物素共價結合到目的蛋白上，便于將靶蛋白固定在鏈酶親和素包被的磁珠上，利用自動化篩選工作站篩選特異的核酸適體［31］。2005年，Eulberg等［32］建立了半自動篩選平臺，篩選出P物質的RNA核酸適體。該系統基于RoboAmp 4200 E并整合了超濾裝置、熒光檢測器、半定量PCR儀等設備，實現了在線監測與靶分子結合的核酸量，并且可滿足在不同緩沖液和試劑以及其它嚴格篩選條件下的篩選要求。上述這些自動化平臺的出現為核酸適體的高通量篩選鋪平了道路。

3.9 變構篩選（Allosteric selection）

變構篩選的構思源于變構核酶：將核酸適體與錘頭狀核酶組合產生變構核酶，靶分子與核酸適體結合時能夠改變核酶構象，激活或抑制核酶部分的活性。變構篩選就是將核酸適體相關結構域隨機化，利用核酶變構催化活性進行篩選，獲得對效應物應答的變構核酶。同時，利用核酶裂解底物序列的活性，可以很容易實現結合核酸適體與游離核酸適體的分離［33］。例如，Soukup 等（2000）將體外篩選得到的茶堿核酸適體與錘頭狀核酶整合，二者連接區隨機化，然后以茶堿為靶標進行第二次篩選，獲得茶堿特異的核酶。在核酸適體與茶堿結合時，連接區空間結構改變，進而激活核酶活性。得到連接區序列后，若將茶堿核酸適體序列隨機突變，篩選茶堿類似物，可以很容易得到對茶堿類似物應答的變構核酶［34］。

3.10 復合靶解析（Deconvolution selection）

適配子篩選一般以純蛋白和小分子量單一物質為靶標，復合靶SELEX（Complex targets SELEX）則是同時以數種分子為靶標，篩選出相互間無干擾的多種靶分子的適配子。Morris等（1998）［35］采用復合靶SELEX方法進行25輪篩選得到紅細胞空殼的ssDNA適配子，并通過光親和性交聯實驗證實不同適配子群所識別的靶分子不同。另外，他們應用復合靶解析SELEX（Deconvolution SELEX）篩選出每一靶標的適配子，即以前面25輪循環所得適配子文庫進行PCR擴增，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化分離ssDNA，再與復合靶交聯結合后，SDS-PAGE分離結合產物并轉移至硝酸纖維膜（NC膜），放射自顯影檢測交聯產物，切下NC膜上蛋白印跡的適當條帶直接用于PCR擴增，篩選到單一的DNA分子并進行測序。相似報道還見于人血漿和γ-羧基谷氨酸蛋白復合靶適配子的篩選［36， 37］。

4 核酸適體技術在食品安全分析中的應用

目前一些有毒有害物質的分析方法已經不能滿足對現有有毒物質的分析，因此需要進一步發展新的檢測有毒有害物質的方法。核酸適體可以借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間作用力形成特殊的三維結構，如發夾、假結、凸環、G-四聚體等，從而特異地識別靶物質。核酸適體具有許多優點：（1）靶分子范圍廣。小到ATP、氨基酸、核苷酸、金屬離子等小分子物質、大到酶、生長因子、細胞粘附分子等生物大分子，甚至完整的病毒、細菌和細胞等都可作為適體篩選的靶物質；（2）親和力強。核酸適體與靶分子的結合強度高，解離常數（Kd）可達

SymbolmA@ M～pM水平；（3）特異性高。可以識別靶物質一個甲基、羥基的細微變化；（4）制備、修飾方便快速。通過化學合成的方法可以在體外快速靈活地合成所需要的各種DNA序列，而且可以進行精確的位點修飾，如熒光標記、生物素標記等。核酸本身特有的這些生化特性使其在有毒有害物質的分析中起著十分重要的作用。

4.1 在金屬離子分析中的應用

因為核酸適體能夠識別一些特殊離子， 如K＋， Pb2＋， Hg2＋等，并形成特定的二級結構，所以常常利用核酸適體設計的重金屬傳感器作為環境分析、監測的重要手段。Huang等［38］利用一段ATP結合的核酸適體形成的G-四聯體來檢測K＋。G-四聯體是一系列鳥嘌呤依靠氫鍵和離子之間的相互作用來穩定，因此，核酸適體折疊的程度與K＋的濃度密切相關。通過核酸適體設計的K＋傳感器能夠直接用于測定人體尿液中K＋的含量，并作為腎臟疾病的重要指標。Liu等［39］利用離子依賴型的核酸適體折疊形成的生物傳感器， 特異性地檢測土壤和池塘樣品中Pb2＋和Hg2＋的含量。其本原理是通過Hg2＋能夠誘導特定的核酸適體形成發夾狀結構，而Pb2＋則使得一段特異性識別凝血酶的核酸適體折疊形成G-四聯體的形式。基于核酸適體檢測的金屬元素還包括Zn2＋［40］， Ni2＋［41］等。凌紹明等［42］利用核酸適體修飾納米金共振散射光譜探針快速檢測痕量Pb2＋，方法檢出限為0.03 nmol/L。

4.2 在生物毒素分析中的應用

唐吉軍等［43］采用指數富集配基的系統進化（SELEX）技術從隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得特異識別蓖麻毒素靶分子的適配子。將毛細管電泳技術作為分離手段引入到SELEX篩選中，利用毛細管電泳高效的分離能力使得篩選周期大大縮短。酶聯免疫和斑點雜交實驗結果表明，僅經4輪篩選即可獲得特異識別蓖麻毒素蛋白的寡核苷酸適配子。Tang等［44］建立了基于DNA核酸適體技術的相思子毒素分析方法，方法檢出限為1 nmol/L，線性范圍為1～400 nmol/L。江麗等［45］用SELEX技術篩選了葡萄球菌腸毒素B（SEB）特異性適配體，經過13輪篩選，ssDNA文庫與SEB的結合率從1.1%提高到39.8%，制備的適配體針對SEB的特異性強，與葡萄球菌A蛋白（SPA）及牛血清蛋白（BSA）無特異性結合。Jorge等［46］首次將核酸適體應用到食物中霉菌毒素的檢測中，他們篩選出了毒枝菌素的核酸適體，并在小麥樣品檢測出ng級別的毒枝菌素。

4.3 在抗生素分析中的應用

人類發現并應用抗生素，是人類的一大革命，從此人類有了可以同死神進行抗爭的一大武器。然而，大量及濫用抗生素，也給人類帶了諸多毒副作用。抗生素分析研究日新月異，SELEX技術也廣泛應用于各種抗生素的分析檢測中，如卡那霉素A（Kanamycin A）［47］、卡那霉素B（Kanamycin B）［48］、鏈霉素類（Streptomycin）［49］、新霉素（Neomycin）［50］、妥布拉霉素（Tobramycin）［51］、利維霉素（Lividomycin）［47，52］、默諾霉素（Moenmycin A）［53］、氯霉素（Chloramphenicol）［54］、四環素（Tetracycline） ［55，56］ 等，分析方法的詳細信息見表1。

Kim等［57］（2010）以其前期篩選獲得的四環素核酸適體為分子識別元件，構建了四環素-電化學生物傳感器，四環素與核酸適體的特異性結合， 在傳感器信號輸出上表現為：隨四環素濃度增加對應電流降低的顯著性響應。此方法對四環素的最低檢出限為10 nmol/L，線性檢測范圍在0.01～10

SymbolmA@ mol/L之間。如圖2所示，在四環素與其它3種結構類似物的核酸適體電化學分析中，四環素對應的電流變化響應與3種類似物的電流變化響應存在顯著差異，表明四環素核酸適體電化學傳感器對四環素的分析中特異性十分理想。 圖2 四環素適體傳感器的檢測特異性分析結果［52］

Fig.2 Specificity of aptasensors of tetracyclines［52］

TET： 四環素（Tetracycline）；OTC：土霉素（Oxytetracycline）；DOX：脫氧土霉素（Doxycycline）；DCF：雙氯芬酸（Diclofenac）。

4.4 在工業染料分析中的應用

自1990年SELEX技術提出以來，就成功地應用于有機染料的分析中。利用RNA適配子檢出限為100～600

SymbolmA@ mol/L［3］； 利用RNA適配子檢出限為33～46

SymbolmA@ mol/L［58］。Grate等［59］報道了RNA適配子檢測孔雀石綠，檢出限可達1

SymbolmA@ mol/L。Wilson等［60］利用DNA適體檢測磺酰羅丹明B，檢出限為190 nmol/L。Brochstedt等［61］研究了4，4′-亞甲基二苯胺 （Methylenedianiline）的核酸適體檢測技術，檢出限為0.15～15

SymbolmA@ mol/L。Sara等［62］結合固相微萃取和核酸適體技術，對魚組織內的孔雀石綠及其隱孔雀石綠進行了快速半定量檢測。結果表明，RNA核酸適體可以用來代替抗體應用于食物中化學殘留物的檢測。SELEX技術在工業染料檢測中的應用不斷的發展，檢測靈敏度大多優于當前普遍使用的液相串聯質譜法。

4.5 在興奮劑分析中的應用

興奮劑是能激活或增強中樞神經系統活性的制劑，包括苯丙胺、可卡因、咖啡因和其它黃嘌呤類、煙堿及合成的食欲抑制等。使用興奮劑會對人的身心健康產生許多直接的危害。使用不同種類和不同劑量的興奮藥物，對人體的損害程度也不相同。SELEX技術在興奮劑分析中的應用正在興起。Mannironi等［63］在1997年報道了RNA適體檢測多巴胺的檢出限可達2.8

SymbolmA@ mol/L。有關SELEX技術應用于可卡因分析的研究報告有很多。Baker等［64］（2006）設計了一種檢測可卡因的電化學生物傳感器，他們將亞甲藍（MB）標記的核酸適體通過巰基組裝于約1 mm2的金電極表面。無可卡因存在時，核酸適體只形成一個雙鏈臂，位于端點的MB將遠離金電極；當可卡因存在，核酸適體可形成3個雙鏈臂，使MB靠近金電極，產生電信號變化，達到可卡因的定性定量檢測目的［64］。近期，一種電激發化學發光適體傳感器被成功開發，用以檢測可卡因 ［65］。其原理是，將巰基修飾的可卡因適體再進行Ru（bpy）2（dcbpy）NHS（Fc）修飾，并固定于金顆粒表面表面，同時金顆粒與金電極通過一段剛性核酸片段相互連接。無可卡因存在時，核酸適體僅可形成一段雙鏈區，使得Fc遠離金顆粒表面，不會產生化學發光信號；加入可卡因后，核酸適體形成3個雙鏈區，Fc將靠近金電極，產生化學發光信號。發光信號在0.1 mol/L三丙胺存在下恒壓記錄，可卡因檢出限可達1 nmol/L。此法為方小分子的高靈敏度檢測提供了重要參考。Zhang等［66］（2008）將可卡因識別適體分割為兩段，可卡因存在時，這兩段DNA能夠重新組合為功能性的可卡因適體，并與可卡因形成復合物。此時依次加入納米金和一定濃度的鹽溶液，納米金可聚集變色；而無可卡因時，依次加入納米金和一定濃度的鹽溶液，由于雙段DNA分子中充分顯露的含氮堿基可使DNA包被于納米金表面，使納米金不會輕易聚集，顏色依舊為紅色 ［66］。

4.6 在食品微生物檢測中的應用

Ohk等［67］利用核酸適體與抗體功能化的光導纖維生物傳感器對人工污染的牛肉、雞肉等食品中的李斯特菌進行了特異性檢測，檢測下限為103 CFU/mL； Hye等［68］利用核酸適體與RT-PCR建立了檢測大腸桿菌的方法，線性范圍為10～107 CFU/mL， 檢測下限為10 E.coli/mL； Edith和Alociljac［69］對適配子生物傳感器在微生物檢測中的應用做了較為全面的回顧及展望。自SELEX技術出現以來，已篩選出一些針對病毒、細菌等病原體活性蛋白的寡核苷酸適配子，為流行性疾病的診斷和控制尋找到了一條新的途徑。我們相信，在不遠的將來，SELEX技術將在病原微生物的快速檢測方面發揮更為重要的作用。

5 展 望

作為一類分子識別元件，核酸適體對其靶標具有嚴格的識別力和高度的結合力，同時核酸適體具有分子小、易合成、易修飾、相對穩定等多方面優勢，應用空間十分廣闊。特別值得關注的是，核酸適體對小分子物質同樣具有高度的識別結合能力，這為小分子物質的分離純化及分析檢測提供了理想工具。王巍等［70］指出：雖然目前對于適配體及其篩選方法的研究尚處于起步階段，但其應用領域已從用于檢測的傳感器 發展到用于治療濕性老年性黃斑變性的適配體藥物Macuge。目前，核酸適體技術在小分子物質分析領域的應用才剛剛起步，有很多可深入開發和研究的內容，總結起來主要有以下3個方面。

首先，改善核酸適體的分子特性。目前，人們在此方面的研究主要是增強核酸適體的穩定性，例如2′-氨基嘧啶修飾、2′-氟嘧啶修飾、2′-甲氧基核苷酸修飾、Spiegelmer以及鎖核酸等等。核酸適體分子穩定性的增加，可擴展核酸適體在體內外的應用空間，尤其是提高小分子物質分析檢測過程中對復雜體系或逆性環境的抵抗能力。今后，核酸適體的分子特性改善還可能向提高其對離子強度、溫度、酸堿度以及有機試劑的抵御能力等方面發展。

其次，核酸適體與其它分析技術的結合。核酸適體的分子很小且容易修飾固定，在與靶分子結合后，其分子空間結構可發生顯著改變。這些結構和功能特性使核酸適體可作為理想的分子識別元件，用于生物傳感器以及其它分析技術的開發。目前，核酸適體已經同許多技術和方法相結合以擴展分析范圍或提高分析效果，如熒光技術、納米技術、表面增強拉曼散射、表面等離子共振、磁共振成像、親和色譜、毛細管電泳、色度法、電化學法等等。未來，必將有更多的技術和方法將與核酸適體整合，研究及應用前景非常廣闊。本課題組提出并發展了一種剪裁核酸適體序列和設計靶分子誘導的“光開關”芘激發態二聚體探針的通用方法，用于快速、靈敏和選擇性地檢測復雜樣品體系中的重要分子。利用分子工程的手段將一段寡核苷酸序列分成兩段，并分別標記上芘分子。當有靶分子存在的條件下，兩段核酸適體片段就會被誘導而自組裝形成核酸適體-靶分子的復合物。此時，原本相互遠離的兩個芘分子就彼此靠近形成二聚激發體，從而導致其熒光發射波長從400 nm附近位移至485 nm。本方法通過熒光分析不僅能夠檢測濃度為1

SymbolmA@ mol/L的可卡因，而且可用肉眼直接觀測分辨含量是pmol級的可卡因［71］。

另外，核酸適體與小分子物質結合的分子機制研究也是未來的研究課題。分子識別機制研究一直是人們關心和關注的重要課題，核酸適體結構簡單卻能與廣泛的靶分子緊密結合，這無疑為分子相互作用研究提供理想的研究模型，甚至可能成為實現配體分子的“量體裁衣”目標提供參考依據。

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Application of Aptamers in Food Safety

XU Dun-Ming1， WU Min1， ZOU Yuan2， ZHANG Qiang3， WU Cui-Chen2， ZHOU Yu*1， LIU Xian-Jin3

1（Xiamen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau， Xiamen 361026）

2（College of Chemistry and Chemical Engineering， Xiamen University， Xiamen 361005）

3（Institute of Food Quality Safety and Detection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014）

Abstract Aptamers are all new ligands with a high affinity for considerably differing molecules ranging from large targets as proteins over peptides， complex molecules to drugs and organic small molecules or even metal ions. These molecules are identified and selected through an in vitro process called systematic evolution of ligands by exponential enrichment （SELEX）. Aptamers are widely used， including medical and pharmaceutical basic research， drug development， diagnosis， and therapy. Analytical and separation tools bearing aptamers as molecular recognition and binding elements are another big field of application. The SELEX method was modified over the years in different ways to become more efficient and less time consuming， to reach higher affinities of aptamers selected and higher automation of process. In reviewing this technology， the article covers the topic， following a general introduction， under the headings: the SELEX protocol， the development of aptamers by use of SELEX， and the application of aptamers in food safety.

Keywords Aptamers; Systematic evolution of ligands by exponential enrichment; Food safety; Residue; Small organic molecules; Review

（Received 26 December 2010; accepted 20 March 2011）