采用核磁共振/液相色譜-質譜異相關譜方法開展藥用植物草棉活性提取物中多組分的同步結構分析研究

摘 要 基于不完全分離分析策略，建立了NMR/LC-MS 異相關譜（NMR/LC-MS HCS）方法對系列混合物樣品的LC-MS和NMR譜數據的整合分析，發掘混合物圖譜中來自同一組分的LC-MS和NMR譜數據間的內在相關性。以新疆維吾爾民族藥用植物草棉（Gossypium herbaceam L.）花瓣的乙醇提取物（AB-8-2）為研究對象，以多通道組合閃式色譜技術為分離手段，不完全分離并獲取了組分含量呈連續動態變化的系列混合物，運用NMR/LC-MS HCS方法對提取物中的黃酮苷類成分進行了同步結構分析研究。由于隨組分濃度動態變化的多種譜學信號強度間具有強的正相關性，通過 NMR/LC-MS HCS圖可以獲得系列提取物中同一組分的互補性的LC-MS 和 1H NMR 譜數據，包括保留時間（Rt）、質荷比 (m/z) 和化學位移值 (δ)等關鍵數據。以已解析的關鍵譜學信號為線索，引入LC-MS/MS譜和二維NMR譜進行綜合分析， 成功地從AB-8-2中鑒定出12個黃酮醇苷類化合物，其中還包括2組共流出的同分異構體。結果表明： 通過該新型分析方法可以在離線的情況下通過“數學聯用的方式”實現與在線LC-NMR-MS聯用技術相似的分析功能，這種新型譜學分析方法可以簡化復雜混合物的分離分析過程，實現結構復雜成分以及多組分無需完全分離的快速同步結構鑒定；尤其對于常規分離條件下難以獲得單體的微量成分或極性相近組分群顯示出獨特的解析能力。

關鍵詞 核磁共振/液相色譜-質譜異相關譜; 混合物不完全分離; 多組分同步結構鑒定; 草棉植物; 黃酮苷類

2010-11-21收稿；2011-01-05接受

本文系國家自然科學基金(No. 20775091) 資助項目

 E-mail: zeper@imm.ac.cn

1 引 言

質譜和核磁共振譜是鑒定化合物結構必需的兩種譜學方法。隨著兩者聯用技術LC-NMR-MS［1～3］的出現與發展，顯著加快了天然產物及藥用植物混合物成分的分離與結構鑒定的進程。它具有先分離后分析的特點。目前，由于NMR自身檢測靈敏度的限制，導致其與LC技術聯用時還存在一系列的兼容問題［4～6］，且該儀器較昂貴，使用成本較高。

除了上述聯用技術之外，廣義二維相關譜技術［7］的出現為數據的綜合分析提供了新思路。利用化學計量學中相關性的原理對混合物體系的同種或不同種譜學數據進行關聯分析，從而獲得互補性的譜學信息用于分析鑒定。Hua等［8］采用二維紅外相關譜技術對中藥貝母的產地進行區別分析；李釗等［9］采用基于核磁共振的統計全相關譜（STOCSY）對腎臟中代謝物質系列1H高分辨魔角旋轉NMR譜數據進行歸屬。Corcoran等［10］采用統計異相關譜 (SHY)，對復雜生物混合物樣品的MS譜與1H NMR 譜［10］、CE譜數據［11］進行分析，尋找潛在的生物標志物。廣義二維相關譜技術在復雜混合體系的分析中，運用數學分離代替化學分離，具有不分離分析的特點，這對于混合物體系或色譜共流成分的分析鑒定發揮了重要作用。本研究組曾依據廣義二維相關譜技術的原理，提出了基于不完全分離的分析策略，建立了LC-MS與1H NMR的平行動態譜（NMR/LC-MS parallel dynamic spectroscopy， NMR/LC-MS PDS）［12］。目前，該方法已成功應用于常用中藥連翹水提物的分析［13］。

本研究在NMR/LC-MS PDS 譜的基礎上進行了新的研究和探索，使用MATLAB 軟件編寫及優化數據處理程序，獲取系列混合物組分的 LC-MS 和 1H NMR 譜信號強度間的相關系數，并設定合適的相關系數截取值來產生NMR/LC-MS異相關譜（NMR/LC-MS hetero-correlation spectroscopy，NMR/LC-MS HCS）。混合物中同一組分兩種信號間的相關稱為自相關，兩個不同組分信號間的相關稱為偽相關。由于同一組分的兩種信號隨組分的濃度變化而具有相似的強度變化趨勢，因此自相關系數要高于偽相關系數，通過設定相關系數截取值可將兩者加以區分。通過 NMR/LC-MS HCS譜的可視化結果，可以更直觀地獲得混合物中屬于同一組分的質荷比（m/z）和化學位移值（δ）的相關性信息，從而進一步獲得有關分子離子、碎片離子、化學位移值和偶合裂分等結構信息。NMR/LC-MS HCS方法的原理及實驗流程見圖解1。

第6期代冬梅等： 采用核磁共振/液相色譜-質譜異相關譜方法開展藥用植物草棉活性提取物中多組分的同步結構分析研究

圖解1 基于不完全分離策略建立NMR/LC-MS異相關譜的原理及實驗流程示意圖

Scheme 1 Schematic diagram of theory and experimental processes of the NMR/LC-MS hetero-correlation spectroscopy (NMR/LC-MS HCS) established based on an incompleted separation strategy

新疆維吾爾民族藥用植物草棉（Gossypium herbaceam L.）為棉屬錦葵科 (Oleaceae) 植物。本研究以其花瓣的乙醇提取物（AB-8-2）為研究對象。藥理學研究表明，AB-8-2組分具有明顯的抗老年癡呆活性和一定的抗血栓活性［14，15］。采用多通道組合閃式色譜技術為分離手段，制備組分濃度呈動態變化的系列混合物流分，運用 NMR/LC-MS HCS譜方法，并結合LC-MS/MS和二維NMR譜分析，開展了系列混合物中黃酮苷類化合物的無需完全分離的高效、快速的同步結構分析研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1100系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；QTRAPTM型四極桿-線性離子阱串聯質譜儀（美國AB公司），配有電噴霧離子源(ESI)及Analyst 1.4.2數據處理系統； INOVA-600型核磁共振儀（美國Varian公司）。

甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國Merk公司)； 甲醇(色譜純，天津永大化學試劑開發中心)； 氘代二甲基亞砜（含0.03% (V/V)四甲基硅烷，Cambridge Isotope Laboratories公司)。實驗用水為飲用純凈水，所有液相分析用溶劑均經抽濾、超聲脫氣處理（津騰公司濾膜：水相，0.22

SymbolmA@ m；有機相，0.22

SymbolmA@ m）。

2.2 樣品及組分濃度呈連續動態變化系列混合物的制備

草棉活性提取物（編號AB-8-2）由中國科學院新疆理化技術研究所阿吉艾克拜爾研究員提供。其分離提取的步驟概略如下：將原藥材花瓣粉碎，用70%乙醇提取、濃縮后混懸于適量水中，用大孔樹脂柱富集分離，收集50%～70%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑獲得AB-8-2。

稱取0.6 g草棉活性提取物AB-8-2，加適量甲醇溶解，用 2.3 g 反相硅膠拌樣且干燥后，采用多通道組合閃式色譜分離系統：sq 16×（Isco）Combi Flash， RP C18 （40～60

SymbolmA@ m， Isco 公司），23 g C18 反相閃式色譜柱 (Isco patent pending， RediSepTM)，梯度分離。流動相為甲醇（A）和水（B）， 梯度洗脫：0～180 min，5%～30% A，180～240 min，30%～35% A，240～340 min，35%～50% A，340～560 min，50%～80% A。流速為5 mL/min； 檢測波長為370 nm。以每10 mL為一管自動收集流分并編號，備用。

2.3 測試條件

色譜條件：YMC-Pack Pro C18色譜柱 (150 mm×3.0 mm i.d.， 5

SymbolmA@ m，美國Agilent公司)；以乙腈和01%甲酸為流動相進行梯度洗脫：0～40 min， 15%～55% 乙腈；流速為03 mL/min；紫外吸收檢測波長為370 nm。

質譜條件：負離子檢測方式。噴霧電壓：－4.5 kV；DP電壓：－80 V/－130 V；EP電壓：－9 V/－10 V；源溫度：350 ℃； GS1(霧化氣)：4 MPa；GS2 (干燥氣)：5 MPa。碰撞能量(CE)： －10 eV/－35 eV。均選用線性離子阱模式掃描，掃描速度為1000 Da/s；使用的各種氣路均為氮氣；數據采集及處理軟件采用Analyst software 1.4.2。

1H NMR譜測定條件：操作溫度298 K；采用z梯度三共振探頭；操作軟件為Varian Vnmr 6.0 C；1H NMR譜測定的譜寬：－1×10－6～14×10－6；弛豫延遲：20 s；采樣時間：3.533 min；采樣次數：32；采樣數據點：64 K。1D TOCSY譜混合時間為120 ms；NOESY實驗的預飽和時間為1.6 s，混合時間為800 ms。

2.4 LC-MSn及1H NMR譜測定

LC-UV-MS及LC-MSn譜測定：根據多通道組合閃式色譜分離的結果及溶液顏色的深淺變化，從獲得的所有流分中選出42個系列提取物（間隔3～6個樣品），每份提取物取出0.5 mL溶液，經微孔濾膜過濾，進行LC-MSn譜分析，進樣量10

SymbolmA@ L。

1H NMR譜測定：根據上述LC-UV-MS譜的測定結果，提取物AB-8-2中的組分主要分布在中間一段流分中。從上述42個樣品中挑選出25個樣品，經旋轉蒸發后，用適量甲醇溶解轉移到5 mm NMR譜用測試管中，用氮氣吹干，然后加入0.5 mL氘代二甲基亞砜溶解，進行1H NMR譜測定。

2.5 原始數據處理及相關計算

LC-MS譜數據處理：采用Markerview1.1軟件對原始LC-MS譜數據（ms.wiff）進行峰對齊、去噪音處理后，轉換成文本文件(ms.txt)，其中包括質荷比-保留時間（m/z-Rt）和峰強度的信息。將這些文本文件導入MATLAB軟件，通過編寫的程序處理，保存為質譜數據矩陣（［MS］）。

1H NMR譜數據處理：將原始的1H NMR譜數據在MestReC 4.9.9.6軟件中依次進行傅立葉變換、相較正、基線校正處理，并輸出為文本文件(ASCII 格式的文件)，其中包括化學位移值和峰強度的信息。然后將這些文本文件導入MATLAB軟件，經簡化處理后得到的數據保存為1H NMR 譜數據矩陣（［NMR］）。

相關系數計算：采用MATLAB軟件中的Corrcoef函數計算相關系數矩陣（C：correlation coefficient matrix）。計算公式為：C＝corrcoef ［MS］［NMR］。通過設定合理的相關系數截取值（Cutoff），并用“十”字型標志將MS與1H NMR 譜信號強度間的相關系數矩陣可視化，構成 NMR/LC-MS HCS圖。

3 結果與討論

3.1 提取物AB-8-2的不完全分離結果分析

圖1為提取物AB-8-2的HPLC-UV譜，這12個成分依次被洗脫到不同的流分中，且每個成分的含量在系列流分中呈動態變化。此外，通過比較峰面積可以看出成分之間的含量差異較大。

圖1 提取物AB-8-2 系列流分的HPLC-UV譜（λ＝370 nm）

Fig．1 HPLC-UV chromatogram of series of fractions of gossypium herbocean eoctract， AB-8-2， at λ 370 nm

3.2 組分7的結構解析

圖2 組分 7的1H NMR /LC-MS 異相關圖（相關系數截取值為0.6）。其中δ 6.19 的1H NMR譜信號因與其它組分的信號相重疊，而沒有出現在相關圖中

Fig．2 1H NMR /LC-MS hetero-correlation spectroscopy (HCS） spectrum of constituent 7 with a cutoff of 0.6. The signal at δ 6.19 was overlapped by other signals and was not showed in NMR/LC-MS HCS map

以組分7為例，闡述NMR/LC-MS HCS方法在混合物結構鑒定中的作用及分析流程。圖2為組分7的1H NMR /LC-MS HCS圖。橫坐標為1H NMR 譜的化學位移值（δ），縱坐標為某一保留時間（Rt）處的質荷比（m/z），“十”字型標識代表了系列混合物樣品中 m/z 與 δ 值信號間的相關關系。其中，不同類型的重疊“十”字型標識代表了不同峰型的1H NMR 信號，如單峰、雙峰、多重峰等。在保留時間18.8 min 處的離子與一組1H NMR譜信號之間的相關標識，包括［M－H］－（m/z 463），同位素離子（m/z 464 和m/z 465）與δ 7.96單峰，δ 7.85，6.97，6.49和4.77的雙峰之間存在相關性，這組相關標識表明這一組MS與1H NMR 譜信號是來自混合物中組分7的譜學信號。同時，將這些識別出來的氫譜信號與混合物的1H NMR譜（圖3）進行比對，可進一步確定δ 7.96處的1H NMR譜信號為雙峰（J＝1.8 Hz），δ 7.85為雙二重峰（J＝8.4 Hz，1.8 Hz）。此外，根據現有1H NMR 譜信號間的積分比例及偶合裂分關系，將出現在同一樣品范圍內（119～163號流分）的δ 6.19的雙峰（分布在82～169號流分，是一個多組分信號的重疊峰）也歸屬為組分7的1H NMR信號。

由圖2可知，芳香區域的1H NMR譜信號構成了黃酮化合物B環典型的ABX 偶合系統和A環的AB偶合系統，一個糖的端基質子信號出現在δ 4.77處。因此，可以推斷組分7為具有槲皮素母核的單糖苷類化合物。由 ［M－H］－ (m/z 463) 的LC-MS/MS 譜（圖4）可知，組分7的［M－H］－ (m/z 463)裂解丟失 162 Da 基團產生 m/z 301 的子離子，表明結構中存在一個六碳糖基和槲皮素母核結構。同時，根據前期研究結果［16，17］，在碰撞能量(CE) 35 eV下，組分7產生了強度很高的 Y0

Symbolm@@ （m/z 301) 和強度非常弱的［Y0

Symbolm@@ H］

Symbolm@@

Wingdings_B@ （m/z 300)，可以判斷組分7為槲皮素-3'-O-糖苷類化合物。照射已經歸屬的糖端基質子信號（δ 4.77）獲得糖基部分的1D TOCSY 譜（圖5），從而確定糖基為葡萄糖。通過上述綜合分析，組分 7被鑒定為Quercetin-3'-O-glucoside。

圖4 組分7的［M－H］－離子 (m/z 463) 的LC-MS/MS 譜。其中苷元離子 (Y0

Symbolm@@ ， m/z 301) 的相對強度遠遠大于自由基苷元離子(［Y0

Symbolm@@ H］

Symbolm@@

Wingdings_B@ ， m/z 300)的相對強度，因此確定組分7為3′位糖苷化

Fig．4 LC-MS/MS spectrum of ［M－H］－ ion at m/z 463 of constituent 7. The glycosylation position was determined by comparing the relative abundances of aglycone ion (Y0

Symbolm@@ ， m/z 301) and radical aglycone ion (［Y0

Symbolm@@ H］

Symbolm@@

Wingdings_B@ ， m/z 300)

圖3 AB-8-2的131號流分的混合1H NMR譜。根據NMR/LC-MS 異相關圖的相關性信息從中挖掘出屬于組分7的信號，并進行了歸屬

Fig．3 Downfield regions of the 1H NMR spectrum of No.131 fraction from crude extract AB-8-2. The 1H NMR signals were correlated and assigned to constituent 7 by using NMR/LC-MS HCS method

圖5 組分7的1D TOCSY譜（a）和提取物AB-8-2的151號流分的混合1H NMR譜（糖殘基部分）

Fig．5 1D total correlation spectroscopy (TOCSY) spectrum (a) of constituent 7 and 1H NMR spectrum of sugar moiety of No.151 fraction from crude extract AB-8-2 (b)

3.3 其它成分的結構解析

利用NMR/LC-MS HCS譜進行結構鑒定時，可以遵循從易到難的順序，解析時先從色譜分離度較好的組分入手（如組分7～12），通過 NMR/LC-MS HCS圖依次將每個組分1H NMR譜信號在混合物的1H NMR譜中歸屬。對相鄰較復雜的1H NMR譜信號進行解析。解析時可以剔除那些已歸屬明確的1H NMR譜信號，降低混合物1H NMR譜的復雜性。具體的結構解析思路總結如下：首先根據NMR/LC-MS HCS譜提供的相關信息，初步確定化合物的母核結構（如m/z 301提示有槲皮素母核，m/z 285提示有山奈酚母核），糖的數目（端基質子的數目），特征取代基（如甲氧基）；再根據LC-MS/MS譜提供的裂解信息，推測糖的種類（如丟失162Da提示有六碳糖），取代基種類（丟失15Da提示有甲氧基），糖基的取代位置（黃酮母核的3位取代（如組分2，4，5，10）， 7位取代（如組分1，6，9），3'位取代（組分7））；通過照射糖基的端基質子信號獲得糖基的1D TOCSY 譜，確定糖的種類，如葡萄糖（組分1，3，5，6，7，8，10），半乳糖（組分2，4）和鼠李糖（組分9）；照射已確定歸屬的質子信號，獲得NOESY譜來確定取代基的連接位置（如組分8和9中的甲氧基）；對于重疊的1H NMR譜信號，可以利用NMR/LC-MS PDS譜進行解析，同時結合黃酮類化合物的結構特點和信號耦合裂分規律，進行拆分歸屬。本研究利用 NMR/LC-MS HCS譜，從AB-8-2 中鑒定了12個黃酮醇苷類化合物，其中還包括2組共流出的同分異構體（組分1，2，3 和組分4，5，6），這些組分的化學結構見表1。

表1 AB-8-2中12個組分的結構

Table 1 Structures of 12 constituents in A-8-2

結構Structure組分序號Constituentnumber支鏈Partial chain組分序號Constituentnumber支鏈Partial chain

OHR2R3OOR1R4R51R1＝R4＝R5＝OH， R2＝OGlc， R3＝H7R1＝R2＝R5＝OH， R3＝OGlc

2R1＝OGal， R2＝R4＝R5＝OH， R3＝H8R1＝R2＝OH， R3＝H， R4＝OGlc， R5＝OCH3

3R1＝OGlc， R2＝R4＝R5＝OH， R3＝H9R1＝R5＝OH， R2＝ORha， R3＝OCH3， R4＝H

4R1＝OGal， R2＝R5＝OH， R3＝R4＝H10R1＝(6″-p-coumaroyl)-Glc， R2＝R5＝OH，

R3＝R4＝H

5R1＝OGlc， R2＝R5＝OH， R3＝R4＝H11R1＝R2＝R4＝R5＝OH， R3＝H

6R1＝R5＝OH， R2＝OGlc， R3＝R4＝H12R1＝R2 =R5＝OH， R3＝R4＝H

4 結 論

本研究利用 NMR/LC-MS 異相關譜技術，開展了新疆維吾爾民族藥用植物草棉活性提取物AB-8-2中黃酮醇類成分的同步結構鑒定研究。通過對 NMR/LC-MS HCS譜中的相關性譜學信息進行綜合分析，基于組分濃度動態變化的多個譜學信號間強度協同變化的規律，將系列組分群中屬于同一組分的LC-MS和1H NMR譜數據（通過獨立測定得到）通過 NMR/LC-MS HCS的相關計算和可視化處理關聯上，進而獲得包括保留時間、質荷比和化學位移值的相關性譜學信息，實現了在不完全分離情況下對活性提取物中多組分的同時結構鑒定。

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Simultaneous Structural Identification of Constituents in Active

Herbal Extract of Gossypium Herbaceam Using Nuclear

Magnetic Resonance/Liquid Chromatography-Mass

Spectrometry Hetero-Correlation Spectroscopy

DAI Dong-Mei1，2， HE Jiu-Ming2， LIU Chao3， SUN Rui-Xiang3， ZHANG Rui-Ping2，

Haji Akber AISA4， Zeper ABLIZ2

1(Key Laboratory for Molecular Design and Nutrition Engineering，

Ningbo Institute of Technology， Zhejiang University， Ningbo 315104)

2(Key Laboratory of Bioactive Substances and Resource Utilization of Chinese Herbal Medicine，

Ministry of Education， Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking

Union Medical College， Beijing 100050)

3(Institute of Computing Technology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080)

4(Xinjiang Technological Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011)

Abstract To simplify and accelerate the analytical routes for structure identification of constituents in complex mixture， based on an incomplete separation strategy， MS/NMR hetero-correlation spectroscopy (MS/NMR-HCS) was developed as a new analytical method to discover the intrinsic correlation between LC-MS and NMR data of the same constituent from mixture spectra. The ethanol crude extract of the petals of Gossypium herbaceam was separated into a series of fractions with the concentration of constituent dynamic variation by flash column chromatography. NMR/LC-MS HCS method was applied to identify the flavonol glycosides in these fractions. The complementary spectral information of the same individual constituent in the crude extract was simultaneously obtained from the spectra of mixtures， including retention time (Rt)， mass/charge (m/z) and chemical shift (δ). And combined the LC-MS/MS and 2D NMR analysis， twelve constituents including two groups of co-eluted isomers were identified successfully. The results demonstrated that NMR/LC-MS HCS combined with the incompleted separation strategy could achieve the similar function of on-line LC-MS-NMR in an off-line mode by such a “mathematics hyphenated approach”. The new analytical strategy has the potential advantages for simplifying and accelerating the analytical routes for structure identification of constituents in complex mixture. Especially， this method is suitable for analysis and identification of minimum-quantity constituents and constituents with similar polarity which are hardly obtained in routine experimental conditions.

Keywords Nuclear magnetic resonance/liquid chromatography-mass spectrometry hetero-correlation spectroscopy; Incomplete separation strategy; Simultaneous structural identification in mixture; Gossypium herbaceam; Flavonol glycosides

(Received 21 November 2010; accepted 5 January 2011)