離子液體修飾的雜化硅整體柱的制備及其電色譜性能

摘 要 合成了含有烯丙基的離子液體氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(AMIMCl)，采用自由基聚合反應將其固定到含有乙烯基的雜化硅整體柱表面，制備了離子液體修飾的雜化硅整體柱。在酸性環(huán)境下，利用該整體柱分離了核苷酸、酚類物質和苯甲酸類化合物，與未進行修飾的整體柱相比，離子液體修飾的雜化硅整體柱的電滲流反向，分離選擇性明顯提高，這可能是戊基鏈提供的疏水作用、咪唑環(huán)提供的氫鍵作用和靜電作用所導致。以苯甲酸類化合物為分離對象，考察了柱內和柱間重現性，結果表明： 5次連續(xù)進樣的柱內遷移時間相對標準偏差(RSD)小于4.0%，制備的3根柱子柱間遷移時間的RSD為9.0%～9.8%。

關鍵詞 離子液體； 雜化硅整體柱； 毛細管電色譜性能

2010-11-10收稿；2011-01-21接受

本文系國家自然科學基金項目(No.20575049)資助

 E-mail: hchenhao@mail.hzau.edu.cn; zrzeng@whu.edu.cn

1 引 言

室溫離子液體(Room temperature ionic liquids， ILs)是指在室溫或接近室溫下呈現液態(tài)的、完全由陰陽離子所組成的鹽，也稱低溫熔融鹽。它一般由有機陽離子和無機陰離子組成，常見的陽離子有季銨鹽離子、季磷鹽離子、咪唑鹽離子和吡咯鹽離子等，陰離子有鹵素離子、四氟硼酸根離子、六氟磷酸根離子等［1］。離子液體具有低揮發(fā)性、高的穩(wěn)定性、寬的電導窗口以及結構的可調性和雙重性等優(yōu)點，在催化［2，3］、合成［3，4］、分離提純［5，6］和電化學［7，8］方面得到了廣泛的應用。

離子液體在色譜方面的研究應用自本世紀以來陸續(xù)得以開展［9，10］。在液相色譜中，離子液體作為添加劑可以改善分離效果，高溫咪唑離子液體用作氣相色譜固定相也有研究報道［11］。另外，利用離子液體的優(yōu)良溶解性溶解環(huán)糊精，并用作氣相色譜的固定相對異構體的分離也得到了很好的結果［12］。在毛細管電泳方面，離子液體已經被用作緩沖溶液添加劑［13］和背景電解質［14，15］等。離子液體的引入，有效地改善了被分析物的分離度，提高了分離效率［16］。本課題組曾采用離子液體作為毛細管電色譜的動態(tài)涂層進行了研究［17］。然而，上述研究大多圍繞動態(tài)修飾和靜電力吸附展開。為了有效減少待測物的吸附量，提高重現性，故可以將離子液體固定在毛細管表面。Qin等［18］將咪唑離子液體通過共價鍵鍵合到毛細管開管柱內壁上，使電滲流反向，從而消除硅膠毛細管柱內表面硅羥基對分析物的吸附，成功分離了生物樣品。

本研究合成了含有烯丙基的離子液體氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(1-Allyl-3-methyl imidazole chloride， AMIMCl)和含有乙烯基的雜化硅整體柱，采用自由基引發(fā)聚合反應把含有烯丙基的離子液體化學鍵合到雜化硅整體柱上，使離子液體固定化，從而減少了離子液體的用量，并分別用于毛細管電色譜分離核苷酸、酚類和苯甲酸類物質，與未修飾柱相比，電滲流發(fā)生了反向，陽極電滲流的出現可以消除硅膠毛細管柱內表面硅羥基對分析物的吸附，分離選擇性明顯提高。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Beckman P/ACETM MDQ毛細管電泳儀， 配備PDA檢測器(美國Beckman Coulter公司)。未涂層石英毛細管(40.2 cm×75

SymbolmA@ m I.D.， 河北鑫諾光纖廠)；SY-1200型超聲波發(fā)生器(上海聲源儀器設備有限公司)；DF-2101B型集熱式恒溫磁力攪拌器(浙江樂成電器廠)；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海索譜儀器有限公司)。SP-6800A型氣相色譜儀(山東魯南瑞虹化學儀器有限公司)；JSM-5600LV型掃描電鏡(日本JEOL公司)；Avatar 360型傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)；Bruker AV400型核磁共振儀(德國Bruker Optics公司)。

四甲氧基硅烷(Tetramethoxysilane， TMOS)；乙烯基三甲氧基硅烷（Vinyltrimelhoxysilane， VTMS）購自武漢大學化工廠；偶氮二異丁腈(2，2′-Azodiisobutyronitrile， AIBN)、PEG (Mw ＝10，000)、尿素、萘酚均購自國藥集團化學試劑有限公司；核苷酸標準品(5-尿苷單磷酸(Uridine monophosphate， 5′-UMP)、5-鳥苷單磷酸(5′-Guanosine monophosphate， 5′-GMP)， 5-胞苷單磷酸(Cytidine 5′-monophosphate， 5′-CMP)， 5-腺苷單磷酸(Adenosine-5'-monophosphoric acid， 5′-AMP)， 2，3-環(huán)鳥苷單磷酸(Guanosine-2'，3'-cyclic monophosphate， 2′，3′-cGMP)， 2，3-環(huán)腺苷單磷酸(Adenosine-2′，3′-cyclic monophosphate， 2′，3′-cAMP)， 2，3-環(huán)尿苷單磷酸(Uridine-2′，3′-cyclic monophosphate， 2′，3′-cUMP)和2，3-環(huán)胞苷單磷酸(Cytidine-2′，3′-cyclic monophosphate， 2′，3′-cCMP)購自美國Acros Organics公司，酚類物質和苯甲酸類化合物購自美國Sigma公司。使用的二次蒸餾水由SZ-93亞榮雙重純水蒸餾器制備。配制20 mmol/LNaH2PO4溶液，并用三乙胺調節(jié)至所需pH值，用作分離緩沖液。樣品用甲醇(色譜純，國藥集團)溶解，混合后用緩沖液稀釋至所需的濃度。緩沖液使用前經超聲脫氣處理并用0.22

SymbolmA@ m的濾膜過濾。

第6期馮 睿等： 離子液體修飾的雜化硅整體柱的制備及其電色譜性能

2.2 實驗方法

2.2.1 氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑的合成 將2.3 g N-甲基咪唑和2.5 g 烯丙基氯加入三口燒瓶中，在N2保護下60 ℃油浴加熱攪拌回流，反應約7 h至溶液成黃色粘稠狀，減壓蒸去過量的烯丙基氯，冷卻至室溫，加無水乙醚萃取除掉殘余的N-甲基咪唑，80 ℃真空干燥，得到淡黃色粘稠液體即為氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑 (1-Allyl-3-methyl imidazole chloride， AMIMCl)。對合成的AMIMCl進行KBr涂膜紅外光譜掃描，3400～3100 cm－1是NH的伸縮振動峰；2900 cm－1處是CH2的反對稱伸縮振動；1650 cm－1是CC的伸縮振動峰。將所合成的樣品AMIMCl溶于氘仿進行1H NMR分析，沒有發(fā)現雜質的共振峰，相關1H NMR數據如下： δ(400 MHz，CDCl3)：10.28 (1H，s， NCHN)， 7.77～7.78(1H， t， NCHCHN)， 755～7.56(1H， t， NCHCHN)， 5.99～6.0 (1H， m， CH2＝CH－CH2)， 5.44(2H， t， CH2＝CH)， 5.02～5.04 (2H， d， ＝C－CH2N)。

2.2.2 毛細管預處理 取新毛細管(75

SymbolmA@ m i.d.)，依次采用甲醇沖洗30 min，1 mol/L NaOH沖洗1 h，0.1 mol/L HCl沖洗30 min，二次蒸餾水沖洗30 min， 直至流出液中性為止。放置于氣相色譜爐中，在N2的保護下以4 ℃/min的速率程序升溫至120 ℃，并停留2 h烘干，待自然冷卻后取出備用。

2.2.3 AMIMCl修飾的雜化硅基質整體柱的制備［19］ 準確稱取50 mg PEG (Mw ＝10000)和20 mg尿素，溶解于0.5 mL 0.01 mol/L的乙酸溶液中，向其中滴加四甲氧基硅烷170

SymbolmA@ L和乙烯基三甲氧基硅烷42.5

SymbolmA@ L，并在冰水浴中劇烈攪拌1 h直至溶液變均一澄清的溶膠液。超聲3 min除去其中的氣泡，并將該溶膠液注入到預處理過的毛細管中，用硅橡皮將毛細管兩端封死并置于50 ℃的恒溫干燥箱中反應陳化18 h，即制得濕的雜化硅整體柱。除去封口，濕的雜化硅整體柱在120 ℃下用0.01 mol/L氨水處理3 h來擴大中孔; 用二次蒸餾水和乙醇去除毛細管中的殘余試劑。放置于氣相色譜爐中，在N2氣的保護下以1 ℃/min的速率從50 ℃升至180 ℃，并保持2 h，即制得干燥的乙烯基雜化硅基質整體柱，記作VTMS-TMOS柱。

將含10 % AMIMCl及1 % (w/V) AIBN的無水乙腈溶液注入到該整體柱中，封口，在70 ℃下自由基聚合反應15 h，即制得所需的離子液體修飾的乙烯基雜化硅基質整體柱，記作AMIMCl-VTMS-TMOS柱，制備過程見圖1。用火焰燒制檢測窗口并裝入電泳卡盒，備用。

圖1 AMIMCl修飾雜化硅整體柱流程圖

Fig．1 Overview of ionic liquid 1-allyl-3-methyl imidazole chloride (AMIMCl)-modified， vinyl-hybrid silica monolith

2.2.4 掃描電鏡觀察和紅外光譜表征 截取5 mm制備的整體柱， 豎直置于導電膠上進行掃描電鏡觀察。剩余在塑料管中的溶膠-凝膠涂層先后用二氯甲烷和水長時間的超聲清洗，充分除去未反應的離子液體和前驅體。然后將涂層真空干燥過夜，取小部分與KBr充分混合碾磨并壓片。以空氣為背景，在400～4000 cm－1范圍內以4 cm－1的分離度進行IR掃描分析。

2.2.5 毛細管電色譜條件

所制備整體柱的毛細管總長為40.2 cm，其中整體柱的有效長度為30 cm，空白長度為10.2 cm。樣品進樣條件為－5 kV下進樣3 s。毛細管分離溫度控制在20 ℃，分離電壓為－15 kV。分離時在毛細管兩端分別加3.45 kPa(50 psi)壓力以防止產生氣泡。檢測波長在214 nm。硫脲用作EOF中性標記物。

3 結果與討論

3.1 整體柱的掃描電鏡觀察和紅外光譜表征

采用掃描電鏡對AMIMCl修飾的整體柱進行形貌觀察。由圖2可見，整體無開裂和收縮現象，硅膠顆粒均勻排列，其間有3～4

SymbolmA@ m的通孔存在。為了考察離子液體是否成功鍵合到雜化硅膠整體柱的表面，采用紅外光譜法對修飾前后的柱子進行表征。紅外光譜圖見圖3。如圖3b所示，1180 cm－1處出現了CN伸縮振動峰，CC雙鍵振動峰(1570 cm－1)消失。表明離子液體已經成功地鍵合到整體柱上。

圖2 整體柱的掃描電鏡圖

Fig．2 SEM photographs of AMIMCl-vinyltrimethoxysilane (VTMS)-tetramethoxysilane (TMOS) column inside a capillary

圖3 修飾前后的整體柱的紅外光譜圖: a， VTMS-TMOS; b， AMIMCl-VTMS-TMOS; c， AMIMCl

Fig．3 IR spectra of (a) VTMS- TMOS column， (b) AMIMCl-VTMS -TMOS column， and (c) AMIMCl

3.2 EOF的表征

離子液體AMIMCl的引入，使整體柱表面帶正電，從而使電滲流發(fā)生反向。為了進一步確認AMIMCl已經成功鍵合到整體柱上，實驗采用硫脲作為中性標記物，考察了修飾后整體柱的電滲流情況，結果見圖4。在AMIMCl的濃度為5%時，電滲流已經出現了反向，這表明AMIMCl已經成功鍵合到整體柱上。考察了不同AMIMCl濃度修飾的整體柱在不同pH值下電滲流的大小。隨著AMIMCl濃度的增加，反向電滲流逐漸增大，這是因為當AMIMCl濃度增加，整體柱表面所帶的正電荷量增大，從而導致反向電滲流增加。而隨著pH值減小，AMIMCl解離度增加，反向電滲流也增大。為了獲得更短的分離時間和更好的分離效果，本研究選取AMIMCl的濃度為10%。

3.3 電色譜性能評價

由于AMIMCl與整體柱鍵合之后，離子液體的烯丙基位置會與含有乙烯基的整體柱之間形成戊基鏈，可以提供一定的疏水作用，而咪唑環(huán)則可以提供一定的氫鍵作用。本研究采用核苷酸、酚類和苯甲酸類化合物對AMIMCl修飾的整體柱的電色譜性能進行評價。

3.3.1 核苷酸

核苷酸在pH＞2.0的溶液中解離，表面帶負電，且隨著pH值增加，表面帶電量增大，核苷酸的電泳方向和電滲流方向相反。在實際分離中，多采用pH＞10.0的條件或加入添加劑使電滲流反向后進行分離。Wang等［20］采用［BMIM］［PF6］萃取生物體內的DNA，獲得了令人滿意的結果。采用本研究離子液體AMIMCl修飾的整體柱，電滲流發(fā)生反向，在電滲和電泳的共同作用下，可以使核苷酸的分離更加快速。8種核苷酸的分離效果見圖5。

圖4 電滲流的表征

Fig．4 Characterization of electroosmotic flow

圖5 核苷酸的分離效果圖: (a) AMIMCl-VTMS-TMOS柱 (b) VTMS-TMOS 柱

Fig．5 Separation of nucleotide acids on AMIMCl-VTMS -TMOS column (a) and VTMS-TMOS column (b)

Buffer， 20 mmol/L triethyl-amine phosphate， containing 10%ACN， pH 4.0; voltage， -15kV; detection wavelength， 214 nm. Peak identification: 1. 2′，3′-cCMP; 2. 5′-CMP; 3. 2′，3′-cUMP; 4. 5′-UMP; 5. 2′，3′-cGMP; 6. 5′-GMP; 7. 2′，3′-cAMP; 8. 5′-AMP. CMP: Cytidine 5′-monophosphate; UMP: Uridine monophosphate; GMP: Guanosine monophosphate; AMP: Adenosine monophosphate．

由圖5可見，經過離子液體AMIMCl修飾的整體柱，可以在pH 4.0的條件下將8種核苷酸分離，而未經修飾的整體柱分離效果不理想。Fuller等［21］認為咪唑環(huán)上C2， C4和C5上的質子可以充當氫鍵的給予體。AMIMCl鍵合到整體柱表面，形成的結構與BMIM通過靜電力絡合到硅膠整體柱上的結構類似。考察8種核苷酸與離子液體之間的作用力，可以推斷，

8種核苷酸與AMIMCl上的咪唑環(huán)形成的氫鍵作用、靜電作用和疏水作用的共同作用導致分離。 圖6 酚類的分離效果圖： (a) AMIMCl-VTMS-TMOS柱 (b) VTMS-TMOS柱

Fig．6 Separation of phenols on AMIMCl-VTMS -TMOS column (a) and VTMS-TMOS column (b)

Buffer， 20 mmol/L triethyl-amine phosphate， containing 20% ACN， pH 4.0; voltage， 15 kV(a) and －15 kV (b); detection wavelength， 214 nm. Peak identification: 1. phenol; 2. 3，5-dimethyl phenol; 3. 2，4-dimethyl phenol; 4. m-cresol; 5. β-naphthol; 6. α-naphthol.

3.3.2 酚類

本節(jié)所選取的酚類物質的pKa均大于8.0，在實驗條件下，均未發(fā)生解離，呈電中性狀態(tài)。6種酚類物質在AMIMCl修飾前后的整體柱上的分離效果見圖6。

從圖6可知，未修飾整體柱VTMS-TMOS柱上在正向分離電壓下，6種酚類化合物同時出峰，在AMIMCl-VTMS-TMOS柱的反向分離電壓條件下，6種酚類可以實現基線分離。由于酚類化合物在實驗條件下并未發(fā)生解離，呈電中性，Yanes等［22］認為此時氫鍵作用對分離的影響不大。考察其保留因子隨緩沖液中乙腈濃度的變化發(fā)現，隨著乙腈濃度的增加，k值下降，因此疏水作用對分離起主要作用。

3.3.3 苯甲酸類

苯甲酸是一類常用的食品防腐劑。聯合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織對其用量有嚴格的限定。本實驗所分離的5種苯甲酸類化合物的pKa均小于5，而實驗條件為pH 5.0，即在本實驗條件下，5種苯甲酸類化合物均未解離，呈電中性，分離效果見圖7。5種苯甲酸在未修飾柱上同時被洗脫，出現單峰；而在經AMIMCl修飾的整體柱上，可以實現較好地分離。這是由戊基提供的疏水作用和咪唑環(huán)提供的氫鍵作用共同作用導致的。

圖7 苯甲酸的分離效果圖： (a) AMIMCl-VTMS-TMOS柱 (b) VTMS-TMOS 柱

Fig．7 Separation of benzoic acid compounds on AMIMCl-VTMS -TMOS column (a) and VTMS-TMOS column (b)

Buffer， 20 mmol/L triethyl-amine phosphate， containing 40%ACN， pH 5.0; voltage， －15 kV; detection wavelength， 214 nm. Peak identification: 1. p-aminobenzoic acid; 2. o-aminobenzoic acid; 3. benzoic acid; 4. o-chlorobenzoic acid; 5. p-chlorobenzoic acid.

3.4 柱重現性考察

采用苯甲酸遷移時間的相對標準偏差衡量離子液體修飾的雜化硅整體柱的重現性。同一根柱子連續(xù)進樣5次，被分析物遷移時間的RSD為4.0%，表明該柱有較好的柱內(Within-column)重現性。在相同條件下制備不同批次的3根該整體柱，經5次連續(xù)進樣分析，被分析物的遷移時間的RSD值在9.0%～9.8% 之間，表明該柱間(Column-to-column)制備重現性令人滿意。

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Ionic Liquid Modified， Hybrid Silica Monolithic Column for

Capillary Electrochromatography

FENG Rui1，2， SHEN Min1， WANG Ming-Ming1， CHEN Hao1， ZENG Zhao-Rui3

1(College of Science， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070)

2(Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Ningbo 315012)

3(College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072)

Abstract An ionic liquid 1-allyl-3-methyl imidazole chloride (AMIMCl) was synthesized and used to modify terminal-vinyl organic-inorganic hybrid silica monolithic column by free radical polymerization procedure using 2，2′-azodiisobutyronitrile (AIBN) as an initiator. Nucleotides， phenols and benzoic acid compounds were successfully separated on the column under acidic conditions and the separation effects were compared with unmodified column. Compared with unmodified monolithic column， the electroosmotic flow was reversed， and the selectivity was apparently improved， which was believed to the hydrophobic interaction on amyl chain or hydrogen bonding interaction on imidazole ring and electrostatic interaction. Reproducibilities of migration times for benzoic acid compounds were reasonable with RSD less than 4.0% for five consecutive within-column runs and were 9.0%－9.8% for column-to-column measurements of three columns， respectively.

Keywords Ionic liquid; Organic-inorganic silica monolithic column; Capillary electrochromatography performance

(Received 10 November 2010; accepted 21 January 2011)