大口徑毛細管氣相色譜法快速測定MRS肉湯培養基中水溶性膽固醇

摘 要 建立了MRS肉湯培養基中水溶性膽固醇的氣相色譜測定法。1 mL樣品（含水溶性膽固醇的MRS肉湯培養基）與5 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液混合，然后于60 ℃水浴皂化30 min。產物游離膽固醇經5 mL甲苯萃取后，采用HP-5大口徑石英毛細管柱（30 m×0.53 mm i.d. ×1.5

SymbolmA@ m）進行分離、FID檢測器進行檢測、外標法進行定量分析。本方法分析一個樣品僅需45 min；在5～250 mg/L濃度范圍內線性關系良好；回收率為95.6%～98.0%；日內與日間相對標準偏差分別為1.6%和1.9%。本方法具有快速、簡便、準確等優點。

關鍵詞 大口徑毛細管； 氣相色譜； 水溶性膽固醇； MRS肉湯培養基

2010-08-03收稿；2011-01-17接受

本文系國家高技術研究發展計劃（No. 2007AAZ354）及國家科技支撐計劃“十一五”奶業重大專項（No. 2006BAD04A09）資助

* E-mail: lanweizhang@yahoo.com.cn

1 引 言

水溶性膽固醇是一類由人工合成的化學物質，在自然界中并不存在。Proksch等［1］于1978年首次報道了以膽固醇、二元酸和聚乙二醇為原料合成水溶性膽固醇的工藝路線。水溶性膽固醇最初被用于質控血清中的膽固醇源，后來其應用范圍逐漸擴展。在微生物學領域，水溶性膽固醇主要用于研究乳酸菌體外對培養基中膽固醇的脫除作用［2，3］。由于膽固醇本身不溶于水，因此在添加到培養基之前必須進行乳化處理，以使其在水相中能穩定存在。而水溶性膽固醇在水中則具有高達60 g/L的溶解度［4］，無需乳化便可直接添加到培養基中，因而被廣泛應用。

為了模擬腸道環境，培養基中水溶性膽固醇的添加量通常為100 mg/L左右［5］。不同乳酸菌對培養基中水溶性膽固醇的脫除能力有很大差別。某些乳酸菌對培養基中水溶性膽固醇的脫除能力可高達80%［6］。這表明當培養結束后，培養基上清液中的水溶性膽固醇的濃度可降低至20 mg/L左右。硫酸-鄰苯二甲醛比色法是目前唯一能夠對如此低含量膽固醇進行檢測的比色法，因而被廣泛應用［3，7］。然而，該方法偶爾會出現原因不明的實驗結果不可重復的現象［8］。因此，有必要開發一種穩定性更好的檢測方法。本研究對氣相色譜測定培養基中水溶性膽固醇的方法進行了研究，獲得了較滿意的結果。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

7890A 型氣相色譜儀配FID檢測器（美國安捷倫公司）；HP-5型石英毛細管柱（30 m×0.53 mm i.d.×1.5

SymbolmA@ m，美國安捷倫公司）； 圖1 水溶性膽固醇的分子結構

Fig.1 Molecular structure of water-soluble cholesterol DK-98-1型數顯恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

膽固醇標準品（純度99.5%）、水溶性膽固醇（純度20%（以游離膽固醇計），分子結構見圖1）及牛膽鹽（牛膽汁凍干粉）購自美國Sigma化學品公司；MRS 肉湯（de Man-rogosa-sharpe）培養基購自英國Oxoid公司， MRS肉湯培養基的配方為：蛋白胨10 g/L，牛肉粉 8 g/L，酵母浸粉 4 g/L，葡萄糖20 g/L，K2HPO4 2 g/L，三水醋酸鈉 5 g/L，檸檬酸三銨 2 g/L，七水硫酸鎂 0.2 g/L，四水硫酸錳 0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L。

2.2 實驗方法

2.2.1 含水溶性膽固醇的MRS肉湯培養基的制備 參照文獻［5］的方法配制。將水溶性膽固醇原始樣品用蒸餾水稀釋至10 g/L，然后將該稀釋液以1%（V/V）的添加量加至含0.3%（m/V） 牛膽鹽的MRS肉湯培養基中，漩渦混勻，即制備成含100 mg/L水溶性膽固醇的MRS肉湯培養基。

2.2.2 樣品前處理條件優化 采用L16（45） 正交設計對前處理過程中的5個潛在的影響因素進行優化。正交設計的因素水平表如表1所示。

1 mol/L Methanolic KOH solution8060正己烷 Hexance10

1 mL樣品與 5 mL皂化溶液分別添加到玻璃螺口試管內，漩渦混勻，然后依照正交表的條件進行皂化。皂化結束后，用自來水將試管內液體冷卻至室溫，然后加入適量萃取劑，漩渦混合60 s，3000×g離心5 min。吸取1 mL 上層有機相，用氮氣吹干，用1 mL 正己烷將其重新溶解，然后進行色譜分析。最終結果以每微升培養基中所含游離膽固醇的峰面積表示。每組實驗重復一次。

2.2.3 色譜分析條件

氫氣作載氣，恒流12 mL/min；不分流進樣模式，不分流時間 1 min，進樣量1.0

SymbolmA@ L；檢測器為FID； 溫度 300 ℃； 空氣400 mL/min，氫氣40 mL/min；補充氣為氮氣，流速20 mL/min；程序升溫條件：起始溫度160 ℃，以40 ℃/min 升至280 ℃，并保持7 min；采用峰面積外標法進行定量分析。

3 結果與討論

3.1 前處理條件優化

在目前色譜柱能夠耐受的溫度范圍內， 水溶性膽固醇無法氣化，并且水溶性膽固醇的分子量也不恒定，因而無法直接采用氣相色譜法對其進行定量分析。然而，水溶性膽固醇是一種酯化形式的膽固醇，其經皂化處理后可轉變成游離膽固醇，后者便可以直接利用氣相色譜法進行檢測。因此，皂化是影響水溶性膽固醇氣相色譜法測定的關鍵步驟。目前，常用的皂化試劑主要有KOH-甲醇溶液［9］和KOH-乙醇溶液［10］；皂化時間從15 min到60 min不等；皂化溫度在50～80 ℃變化。皂化完成后，產物游離膽固醇必須經有機溶劑萃取后才能進行氣相色譜分析。因此，培養基中水溶性膽固醇的皂化產物游離膽固醇的萃取同樣是影響實驗結果的重要步驟。常用的萃取劑主要有甲苯、乙醚、石油醚和正己烷等，而萃取劑與液相的比例通常低于2∶1。

通過正交實驗對上述潛在影響樣品前處理的因素進行了分析。結果表明，在所設定的水平范圍內，5個因素均會對結果產生顯著影響（P<0.05）；極差分析和方差分析的結果均顯示各因素對實驗結果的影響順序為萃取劑類型＞皂化試劑類型＞萃取劑體積＞皂化溫度＞皂化時間；最優條件為：皂化溶液05 mol/L KOH-甲醇溶液、皂化溫度60 ℃、皂化時間30 min、萃取劑為5 mL甲苯。此外，樣品與皂化溶液的體積比也可能是影響實驗結果的潛在因素。本研究未將該因素納入正交設計，而是直接將其固定在1:5，這是因為文獻［11，12］顯示，將樣品和皂化溶液的體積比控制在1∶5可獲得最高的回收率。

3.2 色譜分離

采用上述正交實驗確定的最優條件對膽固醇標準品及樣品分別進行了測定。從圖2可見，即使在不分流的情況下，膽固醇的峰形依然良好，無拖尾現象，而且分析速度較快，膽固醇的保留時間僅為7.6 min，并能和培養基中的其它可萃取成分達到有效分離。

膽固醇為高沸點有機物。在耐高溫毛細管柱未出現時，研究者通常將膽固醇進行衍生處理，以降低其沸點，然后再進行色譜分析［13］。本研究采用的HP-5石英毛細管柱可耐受300 ℃的高溫，這使得直接對膽固醇這種高沸點有機物進行氣相色譜分析成為可能。通常采用內徑為0.32 mm的常規毛細管柱對食品或生物樣品中的膽固醇進行定量分析，本研究采用內徑為0.53 mm的大口徑毛細管柱。大口徑毛細管柱和常規口徑毛細管柱相比，具有較高的柱容量。此特性可以不分流進樣。而不分流進樣則是提高氣相色譜法檢測靈敏度的最直接、也是最有效的措施。

a. 膽固醇標準品（Standard sample， cholesterol）； b. 樣品（含水溶性膽固醇的MRS肉湯培養基）（Sample （MRS broth containing water-soluble cholesterol）；1.溶劑 （Solvent）：甲苯（Toluene）； 2. 膽固醇（Cholesterol）。

3.3 線性范圍及檢出限

分別吸取濃度為1， 2.5， 5， 10， 25和50 mg/L的膽固醇標準溶液，按照3.1節確定的最優條件進行前處理，然后進行色譜分析。結果表明，在1～50 mg/L濃度范圍內，膽固醇標準溶液進樣濃度（X）與其峰面積（Y）呈良好線性關系。其線性方程為 Y＝23.45X－4.64，相關系數R＝0.9998。將標準溶液進樣濃度折算成樣品進樣濃度，則在5～250 mg/L濃度范圍內，膽固醇進樣濃度（X）與其峰面積（Y）之間的線性關系為Y＝4.69X－4.64。

根據信噪比S/N＝3計算得膽固醇檢出限為0.12 mg/L。將膽固醇標準溶液濃度折算成樣品濃度，則樣品中水溶性膽固醇的檢出限為0.6 mg/L（以游離膽固醇計）。

3.4 方法的精密度及標準加入回收率

3.4.1 精密度 將2.2.1節制備的樣品用含0.3%（m/V）牛膽鹽的MRS肉湯培養基稀釋5倍，然后用該混合物進行準確度及精密度實驗。取18份上述樣品，每天測定6份，連續測定3 d。基于方差分析求取日間標準偏差、日內標準偏差及總的標準偏差。結果表明，本方法具有較高的精密度。日內與日間相對標準偏差分別為1.6%和1.9%。

3.4.2 準確加入的回收率 采用加樣回收法測定方法的準確度。取12份上述樣品，分成4組，每組3份，分別向每組樣品中添加0， 20， 50和80 mg/L膽固醇，然后進行色譜分析。樣品中膽固醇測量值為22.9 mg/L。膽固醇添加濃度為20， 50和80 mg/L的回收率（n＝3）分別為98.0%， 95.6%和96.2%。

References

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Rapid Determination of Water-Soluble Cholesterol in MRS Broth by

Wide-Bore Capillary Gas Chromatography

GUO Chun-Feng， ZHANG Lan-Wei， LI Jing-Yan， ZHANG Ying-Chun， YI Hua-Xi， DU Ming， HAN Xue

（School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin 150090）

Abstract A method for water-soluble cholesterol quantification in de Man-Rogosa-Sharpe（MRS） broth based on capillary gas chromatography was developed. Samples （1 mL） were saponified in capped tubes with 5 mL methanolic KOH solution （0.5 mol/L） by heating for 30 min at 60 ℃. The product （cholesterol） was extracted with toluene， and directly analyzed by gas chromatography. The analysis was carried out using a wide-bore column HP-5 （30 m×0.53 mm i.d.×1.5

SymbolmA@ m）， FID detector and external standard method for quantification. With this method， a single sample could be analyzed in 45 min. The linearity was excellent for the concentration range of 5－250 mg/L. The recovery and overall relative standard deviation （RSD） were 95.6%－98.0% and 1.6%， respectively. This method is rapid， simple and accurate.

Keywords Wide-bore capillary; Gas chromatography; Water-soluble cholesterol; de Man-Rogosa-Sharpe（MRS） broth

（Received 3 August 2010; accepted 17 January 2011）