中空纖維液相微萃取同時快速研究6種黃酮類藥物與蛋白的結合特性

摘 要 將中空纖維液相微萃取（HFLPME）-高效液相色譜法（HPLC）與Bjerrum或Scatchard法結合，同時、快速研究了6種黃酮類化合物的蛋白結合率、結合常數和結合位點數。最佳萃取條件為：聚偏氟乙烯作為有機溶劑載體，正庚醇作為萃取相，攪拌速度900 r/min，萃取時間2 h。在最佳條件下，二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素、山柰素、異鼠李素和白楊素與BSA結合率分別為29.3%， 56.8%， 12.2%， 25.7%， 25.2%和12.8%。6種黃酮類化合物共存時對蛋白結合無競爭作用。蛋白結合率對BSA濃度無依賴性，但是部分黃酮類藥物蛋白結合率對藥物濃度有一定的依賴性。本方法簡單， 可靠。

關鍵詞 中空纖維液相微萃取； 黃酮類化合物； 蛋白結合率； 蛋白結合常數； 蛋白結合位點數

2010-11-03收稿；2011-01-06接受

本文系國家自然科學基金（No. 81041084）， 山西省自然科學基金（No. 2007011086）和山西醫科大學科技創新基金資助

 E-mail: bxh246@126.com

1 引 言

黃酮類化合物（Flavonoids compounds）在蔬菜、水果、牧草及藥用植物中分布廣泛，種類繁多，是植物在長期自然選擇過程中產生的一些次級代謝產物。黃酮類化合物具有廣譜的藥理活性， 如抗菌、消炎、降壓、抗氧化、抗癌及防癌等。藥物血漿蛋白結合率是藥代動力學的重要參數之一，影響藥物在體內的分布、代謝和排泄速率，對藥物的消除半衰期也有影響，更重要的是它與藥物的藥理作用強度密切相關。因此，藥物血漿蛋白結合率的研究對新藥研究開發及指導臨床合理用藥都具有重要意義。測定藥物血漿蛋白結合率的方法有平衡透析法［1］、超濾法［2］、微透析法［3］、毛細管電泳法［4］及高效親和色譜法［5］等，研究黃酮類化合物與蛋白結合特性的方法主要有紫外光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法和紅外光譜法。徐倩等［6］采用分子對接理論和熒光法研究了4種黃酮類天然產物與白蛋白的相互作用及作用機理。但尚未見黃酮類化合物與蛋白結合率的文獻報道。近年來，中空纖維液相微萃取（Hollow fiber liquid phase microextraction， HFLPME）對復雜樣品中微量組分的提取、分離、富集和濃縮起重要作用［7］。中空纖維具有能使藥物分子通過，生物大分子或結合藥物的生物大分子不能通過的特殊結構。利用中空纖維的結構特性測定藥物與蛋白的結合率已有報道［8～10］。本研究采用該方法，同時、快速測定了6種黃酮類化合物與牛血清白蛋白的結合率；分析了6種黃酮類化合物同時存在時對蛋白結合的競爭作用；討論了黃酮類化合物蛋白結合率的濃度依賴性；計算了結合常數和結合位點數。

2 方法原理

HFLPME是將水相中的游離藥物通過中空纖維的壁孔萃取到其管內微升級的有機溶劑萃取相中，萃取達平衡時，萃取相中分析物濃度與樣品的初始濃度呈線性關系。當藥物與蛋白結合達到平衡時，水相中的藥物一部分以蛋白結合型藥物存在，一部分以游離型藥物存在。游離型藥物通過中空纖維的壁孔被萃取到萃取相中，結合型藥物被中空纖維壁的微孔有效阻擋，使蛋白結合型藥物與游離型藥物有效分離。在生物體條件下，利用HFLPME結合HPLC測定萃取相中游離藥物（Df）的濃度，用藥物總濃度與游離藥物濃度差值計算結合型藥物（DnP）濃度，從而得出藥物與蛋白結合率。

藥物與蛋白反應達到平衡時，蛋白結合常數K為：

K＝［DnP］［Df］n［Pf］（1）

其中［Df］， ［Pf］， ［DnP］分別表示藥物與蛋白結合達平衡時游離藥物、游離蛋白、藥物-蛋白復合物的平衡濃度。

設藥物的總濃度為［D0］，則：［DnP］＋［Df］＝［D0］（2）

藥物的蛋白結合率fd 為：fd＝［DnP］［D0］＝［D0］－［Df］［D0］（3）

設蛋白總濃度為［P0］，則：［DnP］＋［Pf］＝［P0］（4）

蛋白與藥物的結合位點是相互獨立的，其平衡關系可以用多級平衡方程式（5）表示：

R＝［DnP］［P0］＝［D0］－［Df］［P0］＝mi＝1niKi［Df］1＋Ki［Df］（5）

其中，R為結合比（一個蛋白鍵合的藥物分子數），m為結合位點總類數，ni為第i類位點數，Ki為第i類位點的結合常數。如果藥物與蛋白只有一類結合點位，即m＝1，方程可以簡化為：

R＝nK［Df］1＋K［Df］（6）

第6期張 茜等： 中空纖維液相微萃取同時快速研究6種黃酮類藥物與蛋白的結合特性

Bjerrum方法［10］：根據式（6），以R對log［Df］作圖，得到帶有明顯拐點的S型曲線，即Bjerrum圖。Bjerrum法認為：如果藥物與蛋白的結合分子數與結合位點數相等，Bjerrum曲線拐點處對應縱坐標R值為該藥物與蛋白的結合位點數（即Rmax＝n），Bjerrum曲線拐點對應橫坐標的倒數為K。

Scatchard方法［10］：由式（6）變形得到：

R/［Df］＝nK－RK（7）

根據式（7），以R對R/［Df］作圖或進行線性回歸，得到Scatchard 方程。Scatchard 法認為：假設每個結合位點結合一個藥物分子，則Scatchard 方程斜率的負數為結合常數即K。一個結合位點或幾個結合位點與藥物有相同的親和力，則Scatchard方程為一條直線；如果兩個結合位點有不同的親和力，則Scatchard方程為兩條直線，分別對應兩個結合位點。

3 實驗部分

3.1 儀器與試劑

Technologies 1200 Series高效液相色譜儀（Agilent公司）；槲皮素（批號：081-9003，純度≥98%）和白楊素（批號：111701-200501，純度≥98%）對照品購自中國藥品生物制品檢定所; 山柰素（批號：A0129，純度≥98%）、異鼠李素（批號：A0190，純度≥98%）、楊梅素（批號：A0048，純度≥98%）和二氫楊梅素（批號：A0049，純度≥98%）對照品購自成都曼思特有限公司。其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

3.2 色譜條件

Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm i.d.，5

SymbolmA@ m， Agilent 公司），檢測波長為300 nm，柱溫35 ℃，進樣量20

SymbolmA@ L，流動相乙腈（A）-甲醇（B）-0.3% H3PO4（C）用0.45

SymbolmA@ m微孔濾膜過濾。洗脫程序：0～3 min，35% B ＋ 65% C（V/V），1 mL/min；3～5 min，47% B ＋ 53% C，1 mL/min；5～8 min，26% A ＋21% B ＋53% C，0.6 mL/min；8～12 min，47% B ＋53% C，0.8 mL/min；12～15 min，60%B＋40% C，1 mL/min。

3.3 溶液的制備

3.3.1 對照品溶液的制備 準確稱取二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素、山柰素、異鼠李素和白楊素對照品各6.0， 6.0， 7.5， 7.5， 2.0和6.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成濃度分別為600， 600， 750， 750， 200和600 mg/L的對照品儲備液，于4 ℃冰箱保存，待用。分別準確吸取二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素、山柰素、異鼠李素和白楊素對照品儲備液2.08， 2.08， 1.67， 1.67， 6.25和2.08 mL于25 mL容量瓶中，混勻，用甲醇定容，得6種對照品濃度均為50 mg/L的混合工作液。

3.3.2 BSA溶液的制備 準確稱取7 g牛血清白蛋白粉末于100 mL容量瓶中，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液溶解并定容，得到1000

SymbolmA@ mol/L的牛血清白蛋白儲備液，分裝后于－35 ℃冰箱保存，備用。

3.3.3 樣品溶液的制備 取平底玻璃管，加適量混合工作液和800

SymbolmA@ L BSA儲備液，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至1.5 mL， 作為蛋白溶液；取平底玻璃管，加適量混合工作液，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至1.5 mL， 作為空白溶液。

3.4 實驗步驟

在體積為2 mL的玻璃管中加入1.5 mL樣品溶液，將約10 cm長的聚偏氟乙烯中空纖維管洗凈吹干，在正庚醇溶劑中浸泡30 s，使其孔壁充滿正庚醇，然后將中空纖維折成U形，在管內注入正庚醇。將中空纖維表面的正庚醇擦干，并將其浸入到藥物與蛋白的混合溶液中，在900 r/min攪拌速度下萃取2 h，萃取結束后收集萃取相于5 mL小燒杯中，并用電吹風吹干正庚醇，加入50

SymbolmA@ L甲醇進行HPLC分析。

4 結果與討論

4.1 中空纖維液相微萃取條件的選擇

4.1.1 中空纖維的選擇 利用HFLPME測定藥物與蛋白結合率，不僅要求中空纖維對有機溶劑有一定的親和作用，其孔徑對游離藥物有良好的通透性，而且對生物大分子有極強和有效的阻擋作用。本實驗考察了聚砜（UPIS503）、聚醚砜（UEIS 503）、聚偏氟乙烯（MOF503）和聚丙烯（PP）作為有機溶劑載體對黃酮類化合物萃取效果的影響。根據實驗結果，本實驗選擇聚偏氟乙烯（MOF503）中空纖維作為有機溶劑的載體。

4.1.2 萃取溶劑的選擇 考察了正丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正葵醇作為萃取劑對游離藥物萃取效果的影響。結果表明，正庚醇對黃酮類化合物的萃取效果最好。

4.1.3 攪拌速度的選擇 本實驗涉及兩個平衡；一個是分析物在供相和接受相之間的萃取平衡、另一個是藥物與蛋白的結合平衡。僅就LPME而言，可以增加游離藥物的萃取效率。但是，加速攪拌可能破壞藥物與蛋白的結合，使藥物與蛋白結合率降低。本實驗考察了攪拌速度為0， 300， 600， 900， 1200和1500 r/min對黃酮類化合物萃取及其蛋白結合的影響。實驗表明，攪拌速度為900 r/min時， 萃取效果較好，也不破壞藥物與蛋白的結合。

4.1.4 萃取時間的選擇 在藥物濃度一定的條件下，考察了萃取時間為30， 60， 90， 120， 150和180 min對萃取及蛋白結合的影響。結果表明，萃取時間為120 min時，蛋白結合及微萃取都達到平衡。故本實驗萃取時間選擇為120 min。

4.2 工作曲線制備

取適量對照品混合工作液用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋制成0.1， 0.5， 1， 5， 10和15mg/L系列溶液，按3.4項操作。利用色譜峰面積y對分析物濃度c（mg/L）進行線性回歸，結果見表1。6種藥物的線性關系均良好，r＞0.99。

4.3 藥物-蛋白結合率對濃度的依賴性

4.3.1 藥物-蛋白結合率對蛋白濃度的依賴性 許多藥物與蛋白的結合率依賴于蛋白濃度。本實驗考察了蛋白濃度為0.27， 0.40， 0.53， 0.67和0.80 mol/L時，黃酮類化合物與蛋白的結合率。結果表明，隨著蛋白濃度的增加，體系中游離黃酮類藥物的濃度基本不變，說明藥物-蛋白結合率對蛋白濃度無依賴性。

4.3.2 藥物-蛋白結合率對藥物濃度的依賴性 配制不同濃度的樣品溶液，按照3.4項操作，并求得藥物與蛋白結合率（表2）。由表2可知，對于二氫楊梅素、山柰素、異鼠李素和白楊素，隨著藥物濃度增加，蛋白結合率有所降低，說明這4種藥物的蛋白結合率與藥物濃度有一定的依賴性；對于楊梅素和槲皮素，隨著藥物濃度增加，蛋白結合率基本不變，說明這兩種藥物的蛋白結合率與藥物濃度無依賴性。

25.7±4.4

異鼠李素 Isorhamnetin5.028.4±6.525.2±8.2

白楊素 Chrysin5.013.0±3.612.8±4.7

4.4 6種黃酮類藥物共存對藥物-蛋白結合率的競爭抑制作用

同時服用結構相似的藥物時，可能對蛋白的同一結合部位的不同或相同結合位點產生競爭或抑制，使藥物蛋白結合率發生改變，體內一種或幾種游離藥物濃度增高。因此，本實驗考察了6種藥物共存或單一藥物存在時，藥物與蛋白結合率的差別（表3）。由表3可知，多種黃酮類藥物共存和一種藥物單獨存在時，測得藥物與蛋白結合率相差無幾，說明黃酮類藥物與蛋白結合時是相互獨立的，不存在競爭抑制作用。故本實驗可利用HF-LPME技術，同時、快速測定6種黃酮類藥物與蛋白的結合率。

4.5 蛋白結合常數和結合位點數的測定

4.5.1 Bjerrum方法 配制不同藥物濃度的10

SymbolmA@ mol/L BSA溶液，按照3.4項操作。用R對log［Df］作圖可得到Bjerrum圖，以二氫物梅素和楊梅素為例，如圖1所示。Bjerrum法測得6種黃酮類藥物與蛋白結合常數和結合位點數見表4。圖1 二氫梅素（a）和楊梅素（b）的Bjerrum圖

Fig．1 Bjerrum figure of dihydromyricetin （a） and myricetin （b）

4.5.2 Scatchard方法 同4.5.1項配制BSA溶液，用R對R/［Df］作圖（圖2）或進行線性回歸。Scatchard 方法測得6種黃酮類藥物與蛋白結合常數和結合位點數見表4。

由表3和表4可知，6種黃酮類化合物與BSA的蛋白結合率順序為：楊梅素＞二氫楊梅素＞山柰素＞

Fig．3 Chromatograms of protein solution and flavonoids compounds

a. 不加藥物的蛋白空白溶液; b. 加蛋白的藥物溶液; c. 不加蛋白的藥物溶液。a. Protein blank solution without drug; b. Drug solution with protein; c. Drug solution without protein。1. 二氫楊梅素（Dihydromyricetin）; 2. 楊梅素（Myricetin）; 3. 槲皮素（Quercetin）; 4. 山柰素（Kaempferide）; 5. 異鼠李素（Isorhamnetin）; 6. 白楊素（Chrysin）\\.異鼠李素＞白楊素＞槲皮素；Scatchard法得到的結合常數順序為：楊梅素＞白楊素＞二氫楊梅素＞異鼠李素＞山柰素＞槲皮素；由Bjerrum法作圖得到的結合位點數順序為：楊梅素＞山柰素＞二氫楊梅素＞異鼠李素＞槲皮素＞白楊素。可以看出， 多個藥物分子可能鍵合一個蛋白分子，也可能一個藥物分子鍵合多個蛋白分子；楊梅素與BSA的結合率較高，結合位點數較多（2.8和2），說明楊梅素與BSA結合位點的種類數較多。分析表3和表4可知：結合常數和結合位點數同時影響藥物蛋白結合率的大小。

4.6 聚偏氟乙烯纖維對生物基質的阻擋和對藥物的透過考察

利用HFLPME測定藥物與蛋白結合能力時，不僅要考慮中空纖維對游離藥物的通透性，還應考慮中空纖維對生物大分子或結合藥物的生物大分子的阻擋作用。因此，本實驗考察了聚偏氟乙烯纖維對生物基質的阻擋和對藥物的透過性能，結果見圖3。

由圖3可知， 聚偏氟乙烯纖維對蛋白等生物大分子有良好的阻擋效果，對藥物分子透過性良好。HFLPME萃取藥物與蛋白結合前后游離藥物濃度發生了明顯改變，因此，HFLPME選用聚偏氟乙烯纖維用于藥物的蛋白結合測定。

4.7 液相微萃取平衡對藥物與蛋白結合平衡的影響

基于HFLPME對藥物與蛋白結合參數測定中存在游離藥物LPME平衡和藥物與蛋白結合平衡。若兩平衡之間存在干擾，將直接影響實驗測定結果的準確性。當萃取達平衡時，萃取相與水相萃取平衡常數K＝c1/c2。游離藥物微萃取達平衡時，萃取效率為：

ER＝n1n0×100%＝c1V1c1V1＋c2V0×100%（8）

式中，n0和c0分別為藥物的質量和藥物的總濃度；n1和c1分別為萃取達平衡時萃取相溶液中藥物的質量和藥物濃度；c2為萃取達平衡時水相中藥物的濃度；V0和V1分別為水相和萃取相體積。

在液相微萃取中V1V0，式（8）變為：ER≈KV1V0， V1V0 1。所以，ER1，即n1n0。可見，經HFLPME后水相溶液中游離藥物的濃度幾乎不變，萃取平衡不影響藥物與蛋白結合的平衡。

本研究利用HFLPME，不經分離，同時、快速測定了6種黃酮類化合物的蛋白結合率，并結合Bjerrum法和Scatchard法計算了6種藥物與牛血清白蛋白的結合常數及結合位點數。結果表明，多種黃酮類藥物共存時，利用HFLPME，可不經分離，同時、快速測定其蛋白結合率，不存在競爭抑制；黃酮類藥物的結構、性質不同導致與蛋白的結合率、結合常數、結合類型及結合位點數不同，從而影響藥物與蛋白結合率。

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Simultaneous and Fast Research of Protein Binding Characteristic of

Six Flavonoids Drugs by Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction

ZHANG Xi， CHEN Xuan， BAI Xiao-Hong

（College of Pharm. Shanxi Medical University， Taiyuan 030001）

Abstract Hollow fiber-liquid phase microextraction-high performance liquid chromatography （HF-LPME -HPLC） combined with Bjerrum and Scatchard methods was applied to simultaneous and fast research of protein binding rates， protein binding constants and binding sites of flavonoids compounds. The optimal extraction conditions were polyvinylidene fluoride（PVDF） as organic solvent carrier， n-heptylalcohol as extracion phase， 900 r/min of stirring rate and 2 h of extraction time. Under the optimal conditions， the protein binding rates of six flavonoids compounds， dihydromyricetin， myricetin， quercetin， kaempteride， isorhamnetin and chrysin， were 29.3%， 56.8%， 12.2%， 25.7%， 25.2% and 12.8%， respectively. Six kinds of flavonoids compounds when coexisted did not competitively combine with protein. The protein binding rates of flavonoids compounds did not depend on protein concentrations， but part of them depended on drug concentrations. This method is simple and effective.

Keywords Hollow fiber liquid phase microextraction; Flavonoids compounds; Protein binding rates; Protein binding contants; Protein binding sites

（Received 3 November 2010; accepted 6 January 2011）