高速逆流色譜分離制備甜瓜蒂中葫蘆素類化合物

摘 要 采用高速逆流色譜法分離制備了甜瓜蒂中3種葫蘆素類化合物。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.2∶0.8∶0.8∶1.2，V/V）為兩相溶劑系統，上相為固定相，下相為流動相。在主機轉速 800 r/min、流動相流速2.0 mL/min、分離溫度25 ℃、檢測波長 254 nm條件下進行分離，所得產物純度經HPLC檢測，結構經MS、1H-NMR 和13C-NMR 鑒定。 4 h內從200 mg 經XAD-16大孔樹脂預處理的粗提物中一步分離制備得到33.5 mg葫蘆素B、21.7 mg葫蘆素E和14.9 mg葫蘆素Ⅰ，純度分別為99.1%、98.3%和97.5%，結構經鑒定與文獻相符。

關鍵詞 高速逆流色譜；甜瓜蒂；葫蘆素B；葫蘆素E；葫蘆素Ⅰ

2010-11-25收稿；2011-01-05接受本文系浙江省中藥現代化專項（No.20060356）和浙江省教育廳科研項目（No.Y201018938）資助

* E-mail: hzlicp@163.com

1 引 言

甜瓜蒂（Pedicellus Melo）為葫蘆科植物甜瓜（Cucumis melo）的干燥成熟果柄。具有涌吐痰食、除濕退黃的功效。甜瓜蒂中含有的葫蘆素（Cucurbitacins）類化合物具有抗腫瘤、保肝、抗炎、提高機體免疫力、改善腸胃等功能［1～3］。目前，市場上用于治療腫瘤疾病的葫蘆素片主要為葫蘆素B和E的混合物。根據中藥現代化的發展趨勢，將葫蘆素進一步分離純化，對提高其療效和生物利用度以及增加靶向性都非常關鍵，有利于在抗腫瘤藥效發揮的同時降低葫蘆素類藥物的毒性［4］，并且有助于進行以葫蘆素為指標性成分的藥材及相關制劑的質量控制。

高速逆流色譜（High-speed counter current chromatography， HSCCC）是一種不需要任何固體支撐體或載體的液-液分配色譜技術［5］。具有樣品回收率高、分離能力強、應用范圍廣、儀器操作簡單、分離量大等優點，因此被廣泛應用于天然產物的分離制備［6～9］。本實驗采用XAD-16大孔樹脂從甜瓜蒂中制備得到粗提物，以高速逆流色譜分離純化粗提物，經一步洗脫分離得到3 種葫蘆素類化合物，分別為葫蘆素B、葫蘆素E和葫蘆素Ⅰ，結構見圖1。利用HSCCC快速分離多種葫蘆素類成分的研究尚未見報道。

圖1 甜瓜蒂中分離出的化合物結構式

Fig．1 Chemical structure of compounds separated from Pedicellus melo

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TBE-300A高速逆流色譜儀（深圳同田生化技術有限公司）; HX-1050型恒溫循環器（北京博醫康實驗儀器有限公司）; UVD-200紫外檢測儀（北京市新技術應用研究所）; TBP-50A恒壓恒流微量泵（上海同田生化技術有限公司）; BSZ-100型自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠）; N2000色譜數據工作站（浙江大學智達信息工程有限公司）； 1200型高效液相色譜儀（美國Aglient 公司）；KQ-250DE 型醫用數控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；PTHW型電熱套（河南愛博特科技發展有限公司）；R-210型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）。

甜瓜蒂（安徽省亳州市真源堂藥業有限公司），經浙江工業大學藥學院生藥教研室鑒定符合《中國藥典》2010 年版一部規定; 正己烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇（分析純，中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；水為二次蒸餾水。

2.2 甜瓜蒂粗提物的制備

將甜瓜蒂藥材適當粉粹，稱取粗粉300 g，加入10倍體積的65%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，過濾，合并濾液減壓濃縮至無醇味。將浸膏水溶后過XAD-16大孔樹脂柱，靜止吸附1.0 h后，依次用30%， 50%和95%乙醇進行洗脫。接收50%乙醇洗脫物，減壓濃縮至浸膏后真空干燥，得淺黃色粉末10.5 g，冷藏，備用。

第6期金再宿等： 高速逆流色譜分離制備甜瓜蒂中葫蘆素類化合物

2.3 兩相溶劑的選擇

本實驗采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水為兩相溶劑體系，按不同配比混合搖勻，靜置后各取上下相2.0 mL，加入放有約1 mg樣品的試管中，漩渦振蕩，待兩相分層且澄清后，分別取上下相1 mL，旋轉蒸干，各加入1.5 mL 甲醇溶解，分別各進行HPLC 測定，計算其分配系數K。

2.4 高效液相色譜條件

Extend C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m，美國Aglient 公司）；流動相：乙腈-水（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：228 nm；柱溫25 ℃；進樣量10

SymbolmA@ L。

2.5 高速逆流色譜分離條件

在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水兩相溶劑系統，將其充分振搖后靜置，分取上相為固定相，下相為流動相，兩相分別超聲脫氣30 min。主機轉速為800 r/min，流動相流速2.0 mL/min，分離溫度25 ℃，檢測波長254 nm，進樣量200 mg，以上下相各取5 mL，進樣。

3 結果與討論

3.1 HSCCC體系的選擇結果

本實驗采取了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系，考察了6種不同體系配比下葫蘆素B、葫蘆素E和葫蘆素Ⅰ的分配系數和分離因子，結果見表1。實驗表明，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.2∶0.8∶0.8∶1.2，V/V）溶劑體系時，可得到最佳的分配系數和分離因子。本實驗選擇此體系分離樣品。

用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.2∶0.8∶0.8∶1.2，V/V）體系分離甜瓜蒂粗提物，進樣量200 mg，HSCCC分離情況見圖2。經分離得到3個主要組分峰A、峰B和峰C，固定相保留率為59%，分離效果良好。

3.3 產物純度的測定

采用2.4項的HPLC方法檢測，甜瓜蒂粗提物的色譜圖見圖3。經HSCCC分離所得3個峰的色譜圖見圖4。3個化合物的純度經測定分別為峰A 99.1%， 峰B 98.3%和峰C 97.5%。去溶劑后干燥稱重，分別為33.5， 21.7和14.9 mg。 圖2 粗提物的高速逆流色譜圖Fig．2 High-speed counter-current chromatographic

（HSCCC） chromatogram of crude extract

4 結 論

本實驗利用高速逆流色譜法對甜瓜蒂粗提物進行了分離純化。在 HSCCC 溶劑系統為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.2∶0.8∶0.8∶1.2，V/V）時，可從甜瓜蒂粗提取物中一步分離制備得 3 種純度較高的葫蘆素類成分，分別為葫蘆素 B，葫蘆素 E和葫蘆素Ⅰ。高速逆流色譜法具有簡便、快速、節省溶劑等特點，對于有效分離甜瓜蒂中葫蘆素類化合物具有較好的應用價值。

References

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Preparative Isolation and Purification of Cucurbitacins from Pedicellus

Melo by High-Speed Counter-corrent Chromatography

JIN Zai-Su1， TIAN Hong-Mei1， TANG Lan1， RAO Gui-Wei2， FANG Ying-Guo2， LI Cheng-Ping2

1（College of Pharmaceutical Sciences ， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014）

2（College of Biology and Environment Engineering， Zhejiang Shuren University ， Hangzhou 310015）

Abstract A preparative high-speed counter-current chromatography （HSCCC） was used to isolate and separate cucurbitacins from Pedicellus Melo. A successful isolation and purification was achieved at the following conditions: the two-phase solvent system composed of n-hexane-ethyl acetate-methanol-water at a volume ratio of 1.2∶0.8∶0.8∶1.2 was selected and the lower phase of the system was used as the mobile phase at the flow rate of 2.0 mL/min， the isolation temperature and revolution speed were set at 25 ℃ and 800 r/min， respectively. In 4.0 h， the isolation produced a total of 33.5 mg cucurbitacin B， 21.7 mg cucurbitacin E， and 14.9 mg cucurbitacin I with purities of 99.1%， 983% and 97.5%， respectively， determined by high performance liquid chromatography from 200 mg crude extract after cleaning-up by XAD-16 macroporous resin， which was necessary for the excellent purification. The chemical structure identification was carried out by 1H- NMR and 13C-NMR.

Keywords High-speed counter-counter chromatography; Pedicellus melo; Cucurbitacin B; Cucurbitacin E; Cucurbitacin I

（Received 25 November 2010; accepted 5 January 2011）