紫杉醇微懸臂梁免疫傳感器方法的研究

摘 要 以巰基化的紫杉醇單抗修飾微梁鍍金表面，制備了高靈敏的紫杉醇微懸臂梁免疫傳感器。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法對(duì)巰基化前后紫杉醇單抗的活性變化，以及巰基化單抗在微梁上的修飾進(jìn)行檢測(cè)與驗(yàn)證。采用紫杉醇微懸臂梁免疫傳感器對(duì)不同濃度的紫杉醇溶液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：雖然巰基化后紫杉醇單抗的活性降低了18.6%，但巰基化紫杉醇單抗可以修飾在微梁鍍金表面；在1～100

SymbolmA@ g/L濃度范圍內(nèi)，微梁的偏轉(zhuǎn)和紫杉醇濃度呈線性關(guān)系，檢出限為0.8

SymbolmA@ g/L（S/N＝3）。利用微懸臂梁免疫傳感器對(duì)血漿中的紫杉醇進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)際測(cè)量值與加入量具有很好的一致性。

關(guān)鍵詞 微懸臂梁免疫傳感器； 紫杉醇； 單克隆抗體

2010-08-22收稿；2010-11-12接受本文系國家自然科學(xué)基金（Nos. 10627201， 10732080）和教育部科技創(chuàng)新工程重大項(xiàng)目培育資金（No.708053）資助課題

* E-mail: zhangqc@ustc.edu.cn; wbaomin@263.net

1 引 言

紫杉醇是迄今發(fā)現(xiàn)的最好天然抗癌藥物之一［1］。紫杉醇的定量方法有液相色譜［2］、質(zhì)譜和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）［3］等。液相色譜是最常用方法，但樣品需要量大，檢測(cè)靈敏度不高；質(zhì)譜法需要昂貴的儀器，前處理復(fù)雜；ELISA方法雖然靈敏度較高，但需要對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記［3］。

作為一種實(shí)時(shí)、高靈敏度、非標(biāo)記的傳感器技術(shù)，微懸臂梁傳感器一直是納米傳感領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。圖1A為微懸臂梁免疫傳感器利用光桿桿方法［4］進(jìn)行檢測(cè)的原理：當(dāng)其一側(cè)表面上發(fā)生抗原抗體間的結(jié)合反應(yīng)時(shí)（圖1B），其上下表面的應(yīng)力差使微梁產(chǎn)生彎曲變形，通過加大激光在微梁尖端反射后光線的光臂（L）長，使微梁尖端發(fā)生納米量級(jí)的位移（Z），放大到位置敏感探測(cè)器靶面（Position sensitive detector， PSD）可探測(cè)微米量級(jí)的位移（S），實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)傳感功能。微懸臂梁傳感器已成功用于蛋白質(zhì)［5］、病毒［6］、細(xì)菌［7］、除草劑［8］及重金屬離子［9～11］等方面的研究。但有關(guān)利用該傳感方法進(jìn)行紫杉醇檢測(cè)的報(bào)道鮮見。

微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一是在鍍金表面修飾抗體分子，主要修飾試劑有鹽酸硫醇亞胺［12］、羧酸硫醇類［5］、環(huán)芳冠醚［13］等。除鹽酸硫醇亞胺法之外，其余方法的主要缺點(diǎn)是抗體與懸臂梁上的金膜非直接連接，有可能導(dǎo)致抗體與抗原反應(yīng)后的應(yīng)力傳遞受損而降低傳感器的靈敏度。本研究利用鹽酸硫醇亞胺法將紫杉醇單抗巰基化，然后將巰基化的紫杉醇單抗修飾在微梁鍍金表面，利用微懸臂梁免疫傳感器對(duì)不同濃度的紫杉醇溶液進(jìn)行檢測(cè)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

微懸臂梁傳感器（北京中科奧納科技有限公司）；蠕動(dòng)泵（保定蘭格公司）；溫控器（日本Shimax公司）；流動(dòng)池（體積約0.5 mL，自制）；微懸臂梁（長200

SymbolmA@ m， 寬20

SymbolmA@ m，厚1

SymbolmA@ m，鍍金層厚度60 nm，美國Veeco公司）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國Therom Fisher公司）。

紫杉醇單抗其制備及純化過程參考文獻(xiàn)［14］；牛血清白蛋白、紫杉醇、2-亞氨基硫烷鹽酸鹽（美國Sigma-Aldrich公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（美國Perice公司）；NaHCO3、濃H2SO4等試劑均為分析純（北京化學(xué)試劑公司）。 圖1光桿桿原理檢測(cè)微梁彎曲（A）和抗原抗體結(jié)合導(dǎo)致微梁彎曲示意圖（B）

Fig．1Schematic diagram of optical lever for detection bending of microcantilever（A）and bending of microcantilever due to the antigen-antibody binding（B）包被液（005 mol/L碳酸鹽緩沖液， pH 9.6），PBS（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液， 150 mmol/L NaCl，pH 75）；PBS-T（PBS， 0.5% Tween-20）；底物稀釋液 （0.01 mol/L檸檬酸， 0.03 mol/L NaH2PO4， pH 5.5）； 終止液（2.0 mol/L H2SO4）。

2.2紫杉醇單抗的巰基化

紫杉醇單抗巰基化反應(yīng)如下：

將45.8

SymbolmA@ L 2.0 g/L 2-亞氨基硫烷鹽酸鹽的去離子水溶液加入到1.0 mL 10 g/L紫杉醇單抗溶液中，室溫下反應(yīng)1 h?；旌衔镉肞BS（含150 mmol/L NaCl和1.0 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 7.2）透析48 h。透析后的巰基化紫杉醇單抗溶液稀釋至1.0 g/L，－40 ℃存儲(chǔ)。

第6期薛長國等： 紫杉醇微懸臂梁免疫傳感器方法的研究

2.3 抗體修飾及紫杉醇的檢測(cè)

將微梁浸入“Piranha dip”溶液（V（H2O2）∶V（H2SO4）＝1∶3）中30 min，用去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?。將微梁放入酶?lián)板的孔中，加入200

SymbolmA@ /L巰基化紫杉醇單抗溶液，每孔200

SymbolmA@ L， 37 ℃反應(yīng)1 h， 以PBS-T洗滌4次。微梁傳感器實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)如圖2所示。修飾巰基化抗體的微梁放入流動(dòng)池中固定，蠕動(dòng)泵以40

SymbolmA@ L/min的流速控制溶液進(jìn)出流動(dòng)池。當(dāng)系統(tǒng)信號(hào)穩(wěn)定后，

Fig．2 Schematic diagram of microcantilever sensor

system

將2 mL紫杉醇溶液（1，10，30，50和100

SymbolmA@ g/L）和2 mL 1 g/L BSA溶液流入流動(dòng)池中。以“Piranha dip”洗過的裸梁為參考梁，固定在流動(dòng)池中，流入2 mL 100

SymbolmA@ g/L的紫杉醇溶液。實(shí)驗(yàn)中，溫控器將流動(dòng)池的溫度穩(wěn)定在（37.50±0.01）℃。

2.4 巰基化抗體活性及微梁表面上修飾巰基化抗體的ELISA實(shí)驗(yàn)

加入0.5 mg/L紫杉醇包被抗原包被酶標(biāo)板，每孔200

SymbolmA@ L，37 ℃包被3 h；以PBS-T洗板3次；加入1% BSA溶液，每孔200

SymbolmA@ L，37 ℃封閉30 min；以PBS-T洗板3次；加入200

SymbolmA@ L 0.2 mg/L紫杉醇單抗和200

SymbolmA@ L 0.2 mg/L巰基化紫杉醇單抗，37 ℃反應(yīng)30 min；將修飾了巰基化抗體的微梁和裸梁放入另外兩個(gè)板孔中；以PBS-T洗板3次；加入1 mg/L辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG的緩沖液溶液，每孔200

SymbolmA@ L，37 ℃結(jié)合30 min；以PBS-T洗板3次；每孔加入200

SymbolmA@ L底物溶液，室溫顯色15 min后加入終止液，每孔100

SymbolmA@ L；在酶標(biāo)儀（λ＝492 nm）上讀取吸光度值。

3 結(jié)果與討論

3.1 巰基化抗體活性的變化及巰基化抗體修飾在懸臂梁鍍金表面的實(shí)驗(yàn)

相同濃度的紫杉醇單克隆抗體巰基化前后的吸光度值分別為1.154和0.939。說明用2-亞

氨基硫烷鹽酸鹽和抗體進(jìn)行的巰基化反應(yīng)造成了18.6%的抗體分子活性損失。巰基化抗體的活性下降可能是由于巰基化過程中導(dǎo)致了抗體部分變性和二硫鍵斷裂。修飾了巰基化單抗的微梁和裸梁的吸光度值分別為0.638和0.079，表明巰基化紫杉醇抗體修飾到微梁鍍金表面上仍具有良好的抗原結(jié)合活性，這是微懸臂梁免疫傳感器檢測(cè)紫杉醇的前提條件。

3.2 微懸臂梁免疫傳感器對(duì)不同濃度紫杉醇溶液的檢測(cè)

在不同濃度的紫杉醇溶液作用下，微梁偏轉(zhuǎn)和時(shí)間的關(guān)系如圖3所示。可見，在流入紫杉

醇溶液后約10～15 min響應(yīng)趨于平穩(wěn)。 圖3 不同濃度的紫杉醇和BSA溶液作用下微梁偏轉(zhuǎn)曲線飾紫杉醇單抗的微梁在流入1 g/L BSA溶液時(shí)無明顯響應(yīng)，而未修飾抗體分子的裸梁在100 SymbolmA@ g/L紫杉醇溶液流入時(shí)，也無明顯響應(yīng)。這表明微梁的偏轉(zhuǎn)是因?yàn)樽仙即寂c鍍金表面上的紫杉醇單抗產(chǎn)生了特異性結(jié)合。這種作用力發(fā)生在微梁的單側(cè)鍍金表面，產(chǎn)生的上下表面應(yīng)力差使微梁偏轉(zhuǎn)［4］，產(chǎn)生了正位移，表明這種特異性結(jié)合在微梁鍍金表面產(chǎn)生了壓應(yīng)力。

3.3 傳感器的響應(yīng)特性和重現(xiàn)性

微梁偏轉(zhuǎn)與紫杉醇濃度關(guān)系如圖4所示。在1～100

SymbolmA@ g/L濃度范圍內(nèi)，微梁偏轉(zhuǎn)值（Δz）隨紫杉醇濃度（C）增加而增大，呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為Δz＝31.06＋2.43C，相關(guān)系數(shù)為

0.998。檢出限為0.8

SymbolmA@ g/L（S/N＝3）。熒光標(biāo)記方法檢測(cè)紫杉醇靈敏度為5.85

SymbolmA@ g/L［15］，液質(zhì)聯(lián)用

檢測(cè)紫杉醇靈敏度為1

SymbolmA@ g/L［2］，低于微管蛋白綁定分析技術(shù)檢測(cè)紫杉醇的靈敏度1.68 ng/L［16］。微懸臂梁免疫傳感器操作簡單，且不需要測(cè)試過程中進(jìn)行標(biāo)記。

考察了微懸臂梁的再生效果。以同一微梁（“Piranha dip”溶液洗后再生）重復(fù)3次檢測(cè)10

SymbolmA@ g/L紫杉醇，微梁偏轉(zhuǎn)值為（70±4.9）nm，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7%。針對(duì)不同微梁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果的重復(fù)性除與微梁間尺寸差異有關(guān)外，還與微梁在“Piranha dip”溶液洗滌時(shí)間及激光照射在微梁上的位置有關(guān)。利用微梁進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，將微梁固定相同位置，將激光束照在微梁尖端固定區(qū)域內(nèi)，實(shí)驗(yàn)中激光光強(qiáng)保持一定誤差范圍，結(jié)果具有較好的重現(xiàn)性。

3.4 實(shí)際樣品測(cè)試

將30 SymbolmA@ g/L紫杉醇血漿溶液流入流動(dòng)池，利用修飾好的3根微梁重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次的測(cè)量平均值為32.8 SymbolmA@ g/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%。測(cè)量值均大于加入量值，這可能由于血漿成分在傳感表面的非特異性吸附。紫杉醇微懸臂梁免疫傳感器的測(cè)試結(jié)果與實(shí)際加入量具有很好的一致性，且傳感器具有一步修飾、響應(yīng)速度快、非標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，正在成為新的研究熱點(diǎn)。

References

1 Wall M E，Wani M C. J. Ethnopharmacol.， 1996， 51（1-3）: 239～253

2 Basileo G， Breda M， Fonte G， Pisano R， James C A. J. Pharmaceut Biomed.， 2003， 32（4-5）: 591～600

3 Leu J G， Chen B X， Schiff P B， Erlanger B F. Cancer Res.， 1993， 53（6）: 1388～1391

4 Huang Y， Liu H， Li K， Chen Y Y， Zhang Q C，Wu X P. Sens. Actuators A， 2008， 148（1）: 329～334

5 Wu G H， Datar R H， Hansen K M， Thundat T， Cote R J， Majumdar A. Nat. Biotechnol.， 2001， 19（9）: 856～860

6 Davila A P， Jang J， Gupta A K， Walter T， Aronson A， Bashir R. Biosens. Bioelectron.， 2007， 22（12）: 3028～3035

7 Braun T， Backmann N， Vogtli M， Bietsch A， Engel A， Lang H P， Gerber C， Hegner M. Biophys. J.， 2006， 90（8）: 2970～2977

8 Suri C R， Kaur J， Gandhi S， Shekhawat G S. Nanotechnology， 2008， 19（23）: 1～6

9 XU Ying-Ming， PAN Hong-Qing， WU San-Hua， ZHANG Bai-Lin（徐英明，潘宏青，伍三華，張柏林）． Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2009， 37（6）: 783～787

10 Xu Y M， Zhang B L， Wu S H，Xia Y. Anal. Chim. Acta， 2009， 649（1）: 117～122

11 Zhao H W， Xue C G， Nan T G， Tan G M， Li Z H， Li Q X， Zhang Q C，Wang B M. Anal. Chim. Acta， 2010， 676（1-2）: 81～86

12 Tan W M， Huang Y， Nan T G， Xue C G， Li Z， Zhang Q C，Wang B M. Anal. Chem.， 2010， 82（2）: 615～620

13 Lee J H， Hwang K S， Park J， Yoon K H， Yoon D S， Kim T S. Biosens. Bioelectron.， 2005， 20（10）: 2157～2162

14 Grothaus P G， Bignami G S， O′Malley S， Harada K E， Byrnes J B， Waller D F， Raybould T J G， McGuire M T， Alvarádo B. J. Nat. Prod.， 1995， 58（7）: 1003～1014

15 Sheikh S H， Abela B A，Mulchandani A. Anal. Biochem.， 2000， 283（1）: 33～38

16 Suye S I， Tandel S， Mulchandani A. Anal. Chem.， 1997， 69（17）: 3633～3635

Research on Paclitaxel Microcantilever Immunosensor

XUE Chang-Guo1， ZHAO Hong-Wei2， WU Shang-Quan1， NAN Tie-Gui2， WANG Bao-Min*2，

ZHANG Qing-Chuan*1， WU Xiao-Ping1

1（Key Laboratory of Mechanical Behavior and Design of Material of Chinese Academy of Sciences，

University of Science and Technology of China， Hefei 230027）

2（College of Agronomy and Biotechnology， China Agricultural University， Beijing 100094）

Abstract A highly sensitive paclitaxel microcantilever immunosensor was fabricated using sulfhydrated anti- paclitaxel monoclonal antibody immobilized on the gold surface of the microcantilever. An enzyme-linked immunosorbent assay was used to evaluate the activity changes of anti-paclitaxel monoclonal antibody before and after sulfhydrylation， and the bingding activity of sulfhydrated anti-paclitaxel monoclonal antibody immobilized on the gold surface of the microcantilever. The experimental results indicated that although the sulfhydrylation of monoclonal antibody caused loss of 18.86% bingding activity， sulfhydrated anti-paclitaxel monoclonal antibody immobilized on the gold surface could maintain its paclitaxel binding activity. The paclitaxel microcantilever immunosensor was used to detect different concentrations of paclitaxel solution. The response showed a linear relationaship to the concentration of paclitaxel in the range of 1－100

SymbolmA@ g/L with a detection limit of 0.8

SymbolmA@ g/L （S/N＝3）. In addition， paclitaxel in human plasma sample was analyzed by microcantilever immunosensor with satisfactory results.

Keywords Microcantilever immunosensor; Paclitaxel; Monoclonal antibody

（Received 22 August 2010; accepted 12 November 2010）