基于二元混合自組裝包裹納米顆粒的微傳感器抗體固定方法

摘 要 采用二元混合自組裝膜修飾納米金顆粒，在經自組裝單分子層修飾的金電極上陣列式排布，并通過共價鍵固定抗體形成生物敏感膜。采用原子力顯微鏡、掃描電鏡和阻抗譜分別對電極表面的修飾過程進行了表征。納米粒子在微電極表面均勻分布，沒有明顯的團聚， 并且可實現抗體有效固定。基于標準互補金屬氧化物半導體（Complementary metal oxide semiconductor， CMOS）工藝和微加工技術，利用該抗體固定化方法，制備了糖化血紅蛋白免疫微傳感器，可同時檢測血液中的糖化血紅蛋白和血紅蛋白含量，其對糖化血紅蛋白和血紅蛋白的檢測范圍分別為14～170

SymbolmA@ g/L和167～570

SymbolmA@ g/L。

關鍵詞 納米金; 互補金屬氧化物半導體; 微加工; 糖化血紅蛋白; 集成芯片

2010-08-10收稿；2010-11-01接受

本文系國家973計劃項目 (No. 2009CB320300)和國家863計劃項目(No. 2006AA04Z366) 資助

 E-mail: shxia@mail.ie.ac.cn

1 引 言

目前，便攜式生物傳感器的研究已成為熱點，但很多免疫傳感器還是基于酶標或者抗原抗體標記等方法，繁瑣、耗時且造價較高［1，2］。一些研究者應用離子敏場效晶體管 （Ion sensitive field-effect transistor， ISFET），在較寬范圍內實現快速免標記的免疫檢測。ISFET以基于標準互補金屬氧化物半導體（Complementary metal oxide semiconductor， CMOS）工藝制備，為生物傳感器微型化及批量生產提供了一種新思路。基于ISFET的微型免疫傳感器，可實現快速無標記檢測。

在免疫傳感器制備過程中，固定抗體是非常關鍵的步驟。隨著傳感器從厘米尺度減小到毫米尺度，免疫傳感器的敏感表面面積也變得很小，可以固定在敏感表面的生物分子量也隨之減少［3］。如何在微型傳感器敏感表面上高效固定生物分子，并且有效控制其表面特性，成為了微型免疫傳感器的研究難點。

納米粒子的引入對于增強表面信號是一個非常有益的手段［4］。納米粒子具有較高的比表面積，使得微型傳感器表面的生物分子固定量呈指數倍增長。自組裝單分子層與生物大分子以分子鍵結合，性能穩定，生物相容性強并能抑制干擾信號。然而單一成分的自組裝分子層容易造成較大的空間位阻，阻礙生物大分子的固定效率。二元混合自組裝膜的二維空間結構能夠降低電極表面固定化抗體的空間位阻，使抗體具有良好的空間分布，有助于抗體的固定，及保持抗體的免疫活性［5］。

本研究在納米金顆粒表面修飾包裹二元混合自組裝膜，再將修飾過的納米金顆粒固定到經自組裝單層膜修飾的電極表面，共價鍵固定抗體形成生物敏感膜。本方法利用了納米顆粒比表面積大的特點，增加了抗體的固定量；同時，納米顆粒引入了特定的功能團，有利于生物分子的穩定結合，并能減少非特異性的結合，降低噪聲干擾。此外，修飾的自組裝膜使納米顆粒在液相中均勻分散，將納米顆粒固化到電極表面后，也能保持均勻分散，有效抑制了納米顆粒的團聚。采用此抗體固定化方法制備了檢測糖化血紅蛋白的微傳感器。本微傳感器由采用標準CMOS工藝加工的場效應傳感集成芯片和采用微加工技術制備的柵電極試條組成［6，7］，可實現糖化血紅蛋白和血紅蛋白的同時檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Gamry Reference 600電化學分析儀 （美國Gamry公司）； S-4800掃描電鏡 （FE-SEM，日本Hitachi公司）； Nanoscope IV原子力顯微鏡 （美國Vecoo公司），輕敲工作模式。

糖化血紅蛋白抗體、血紅蛋白抗體（北京怡成生物技術有限公司）；糖化血紅蛋白質控品（美國Fitzge-rald公司）；巰基乙胺，16-巰基十六酸 （HSC15H30CO2H））， 3-硫基丙酸 （HSCH2CH2CO2H）， 1，2-二氯乙烷（EDC）， N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）， 納米金溶膠 （8～12 nm in diameter）， 磷酸鹽緩沖液 （PBS， pH 7.4）均購自美國Sigma公司； SU8 2100膠（美國MicroChem公司）。其它試劑均為分析純，購自北京化學試劑公司。

2.2 免疫微傳感器制備

微型免疫傳感器包括ISFET集成芯片和一次性微型延長柵電極陣列（圖1）。微型延長柵電極陣列在柔性材料上由MEMS工藝制備，分為糖化血紅蛋白和血紅蛋白兩個通道，每個通道都有金敏感電極和金鈍化電極，兩個通道共用一個鉑參比電極。兩個金敏感電極分別固定糖化血紅蛋白抗體和血紅蛋白抗體，兩個金鈍化電極固定有惰性蛋白。 圖1 （a） 微型糖化血紅蛋白傳感器檢測原理圖; （b）， 微型延長柵電極陣列; （c）， 基于ISFET/REFT的CMOS集成芯片

Fig．1 （a）， Schematic graph of hemoglobin-A1c micro-sensor design; （b）， Photo of micro extended gate electrode array chip; （c）， Photo of integrated chip based on ion sensitive field-effect transistor/reference field-effect transistor（ISFET/REFET）

金電極的圓形敏感面及參比電極的有效部位由SU8膠形成的三維微結構測量池所限定。測量池使得測試試劑用量僅為10

SymbolmA@ L。ISFET集成芯片基于CMOS標準工藝，集成兩組ISFET/參比場效晶體管（Reference field-effect transistor，REFET） 敏感器件和信號處理電路。ISFET和REFET分別與延長柵電極陣列的敏感電極和鈍化電極連接，電極表面的電荷變化影響場效晶體管（Field-effect transistor，FET） 的閾值電壓，敏感電極和鈍化電極的響應以差分電壓的形式輸出。

2.3 生物分子固定化

2.3.1 自組裝單層膜修飾金電極 將電極浸泡于10 mmol/L巰基乙胺的乙醇溶液中12 h，巰基乙胺的巰基可以與金電極表面形成強烈的共價鍵，在金電極表面形成自組裝單層膜。

2.3.2 二元混合自組裝膜包裹納米金 在納米金溶膠溶液中加入10 mol/L 16-巰基十六酸， 3-硫基丙酸1∶1混合液，攪拌，過夜，反復離心清洗，溶于去離子水制成包裹有混合硫醇的納米狀顆粒懸液。

第6期薛茜男等： 基于二元混合自組裝包裹納米顆粒的微傳感器抗體固定方法

2.3.3 納米金的固定 將2.3

SymbolmA@ L EDC與50

SymbolmA@ L 10 g/L NHS振蕩混合均勻后，加入8 mL納米球狀顆粒懸液中，攪拌15 min，活化納米金表面的羧基。將組裝有巰基乙胺的金電極清洗吹干后，在納米球狀顆粒懸液中浸泡2 h。活化的羧基與巰基乙胺的氨基結合，包裹有混合硫醇的納米球狀顆粒組裝到金電極表面，形成納米顆粒陣列。

2.3.4 生物分子固定 在4個金電極敏感表面各滴加EDC-NHS混合溶液0.5

SymbolmA@ L。靜置15 min后，在兩個敏感電極表面分別滴加1.3 g/L糖化血紅蛋白抗體、10 g/L血紅蛋白抗體；在另兩個鈍化電極表面滴加10 g/L牛血清蛋白。于4 ℃密閉濕潤的環境下靜置3 h。通過EDC和NHS表面活性劑的活化，電極表面的羧基形成活性基團與抗體或惰性蛋白表面的氨基穩定結合，使得生物大分子穩定固定于微型電極表面。最后在每個金電極的敏感表面滴加10 g/L牛血清蛋白，于4 ℃密閉濕潤的環境下靜置1 h，以封閉電極表面剩余的活性位點，防止測試溶液中其它蛋白的非特異性吸附給測試結果帶來的偏差。以抗體的固定為例，金電極敏感表面的修飾過程見圖2。

圖2 微型金電極表面修飾過程

Fig．2 Scheme of antibody immobilization progress

3 結果與討論

3.1 掃描電鏡（SEM）表征表面形貌

采用SEM觀測微型電極表面形貌。從圖3可見，金電極表面修飾納米顆粒并固定抗體后，可明顯看到納米顆粒。文獻［8］報道，納米金顆粒通常易在電極表面團聚，且不容易分散均勻。SEM觀測結果表明，此種抗體固定化方法應用于微型電極修飾，可將納米顆粒均勻分布，顆粒尺寸相對一致，約為10～20 nm，未觀察到明顯的團聚現象，有利于抗體的固定。

3.2 原子力顯微鏡（AFM）表征抗體固定過程

AFM的輕敲模式是常用的表面分析方法，對固定化生物膜表面形貌及密度的分析尤其重要，近年來，用AFM輕敲模式法對固定化生物膜表面分子的尺寸分析報導［9］逐漸增多。AFM進行表面分子尺寸分析時，粒子的高度反映了真實值［10］，而粒子在水平方向的寬度與針尖放大效應有關。圖4a為金電極表面組裝有自組裝單分子層的AFM圖， Z軸方向平均高度Rz約為1.814 nm；在修飾過混合自組裝膜包裹的納米顆粒后，均勻、連續地分布著顆粒狀納米結構（圖4b），Rz約為5.393 nm。緊密堆積的表面粒子在Z方向上高度可近似認為緊密堆積的粒子的半徑，其尺度與SEM表征表面形貌尺寸吻合，證明本方法可將納米顆粒成功修飾于電極表面，呈連續密閉分布，且分散均勻。

圖3 抗體-納米顆粒陣列-金微型電極表面SEM圖

Fig．3 Scanning electron microscopy （SEM） images of antibodies-nano particles-SAM-Au surface

圖4 原子力顯微鏡（AFM）表征抗體固定過程：（a） 自組裝分子層修飾金電極; （b）修飾有納米顆粒陣列的金電極表面

Fig．4 Atomic force microscopy （AFM） characterize the process of antibody immobilization: （a） SAM-Au; （b） nano particles-SAM-Au

圖5 阻抗譜檢測微型電極表面圖譜：（a）， 自組裝分子層修飾金電極；（b）， 修飾有納米顆粒陣列的金電極表面；（c）， 抗體固定后的金電極表面

Fig．5 Electrochemical impedance spectroscopy: （a）， SAM-Au; （b）， nano particles-SAM-Au; （c）， antibodies- nano particles-SAM-Au.

3.3 阻抗譜表征抗體固定過程

采用電化學交流阻抗譜對電極表面的修飾過程進行表征，其中交流阻抗譜圖曲線半圓的直徑為電子傳遞的阻抗Ret。圖5顯示了不同修飾電極在含有5 mol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］ 的PBS溶液中的交流阻抗譜圖，其半圓越小，電子傳遞效果越強。如圖5B所示，裸金電極的阻抗譜（曲線a）近似呈直線，顯示出較好的導電性。在其表面組裝有納米顆粒陣列后（曲線b），表面阻抗Ret增大。這是因為納米金顆粒包裹有絕緣性的自組裝膜。抗體固定在微傳感器表面后（曲線c），表面阻抗Ret又略有降低。這是因為糖化血紅蛋白抗體在測試溶液中攜帶有一定電荷量。此結果表明，電極表面的修飾達到了預期的結果，抗體成功固定在微型電極的表面。

3.4 微型傳感器濃度響應曲線

糖化血紅蛋白水平是檢測糖尿病的重要指標，以糖化血紅蛋白 （Hemoglobin-A1c， HbA1c） 占總血紅蛋白 （Hemoglobin） 含量的百分比表示，被美國糖尿病協會列為糖尿病檢測的金指標［11］。考察傳感器對不同濃度糖化血紅蛋白傳感器的響應電位，測試在稀釋的糖化血紅蛋白質控品中進行。其中含有糖化血紅單白、血紅蛋白、牛血清蛋白、PO3－4、Na＋等物質。結果表明，隨著糖化血紅蛋白濃度的增加，傳感器的響應電位相對空白溶液的變化量成比例變化。如圖6所示，糖化血紅蛋白的線性范圍為13.75～170.5

SymbolmA@ g/L， 相關系數為0972，響應靈敏度為17.4 mV/（logCHbA1c）。正常人體中血紅蛋白濃度約為110～160 g/L，糖化血紅蛋白與血紅蛋白比大于7%，即診斷為糖尿病，最高為15%。為了適應人體糖化血紅蛋白水平，并基于微傳感器對糖化血紅蛋白檢測范圍，測試其對167～570

SymbolmA@ g/L血紅蛋白的響應，其響應靈敏度為300 mV/（logCHb），相關系數為0.953。此微型傳感器性能滿足臨床測試需求，并且響應不受雜質離子的影響，可以實現對糖化血紅蛋白和血紅蛋白的同時檢測。 圖6 微傳感器對糖化血紅蛋白（HbA1c）及血紅蛋白（Hb）濃度響應曲線

Fig．6 Response of immunosensor to concentration of HbA1 c

為考察傳感器的臨床應用前景，對糖化血紅蛋白水平為8.4%的實際血樣進行了測試。通常血樣進行測試時需先加入細胞裂解液，裂解紅細胞內的血紅蛋白/糖化血紅蛋白。為適應微型傳感器的檢測范圍，先將實際血樣用裂解液稀釋10倍，再依次用PBS配制0.1%牛血清蛋白溶液和去離子水，將其稀釋30000倍后進行測試。3片微傳感器對同一血樣測試結果為8.51%， 8.69%和8.43%； RSD為1.56%； 回收率為97.03%±2.74%。

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Micro Biosensor Antibody Immobilization Method Based on Mixed

Self-assembly-monolayers Wrapped Nano-particle

XUE Qian-Nan1，2， BIAN Chao1， TONG Jian-Hua1， SUN Ji-Zhou1， ZHANG Hong1， XIA Shan-Hong１

1（State Key Laboratory of Transducer Technology Institute of Electronics，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190）

2 （Graduate University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080）

Abstract Nano-gold particles that wrapped by mixed self-assembly monolayers （SAM） were immobilized on the SAM-modified Au micro electrode surface by amide linkage to form nano-particles array. Subsequently， a sensitive bio-film on the micro immunosensor surface was formed with covalent immobilization of antibodies on the nano-particles. Micro electrode surface modification process was characterized by atomic force microscopy， scanning electron microscope， and electrochemical impe-dance spectroscopy. The results indicated that the nano-particles distributed uniformly without appa-rent aggregation and the antibodies can be effectively immobilized on the microelectrode surface. Using this antibody immobilization method， hemoglobin-A1c （HbAIc） micro-sensors were prepared. Based on complementary metal-oxide-semiconductor （CMOS） standard process and micro-electronic-mechanical system （MEMS） technology， the immunosensor can detect hemoglobin-A1c and hemoglobin simultaneously with the range of 166.7－570

SymbolmA@ g/L hemoglobin and 13.75－170.5

SymbolmA@ g/L HbA1c.

Keywords Nano-gold; Metal-oxide semiconductor; Micro-electronic mechanical system; Hemoglobin-A1c; Integrated chip

（Received 10 August 2010; accepted 1 November 2010）