基于聚硫堇/過氧化氫光電化學敏感界面的膽堿傳感器

摘 要 將膽堿氧化酶固定在具有光電活性的聚硫堇光透電極的表面，利用殼聚糖和戊二醛鍵合膽堿氧化酶制備了光致電化學膽堿傳感器。此傳感器基于同時具有光敏和電子受體功能的聚硫堇光電界面，能與膽堿氧化酶催化膽堿反應產生的電子供體（H2O2）發生光致電化學反應的原理，實現了對膽堿的檢測。探討了傳感器的光致電化學響應機理、偏壓、光強及電解質溶液pH對測定膽堿的影響。傳感器對膽堿的測定范圍為005～2.00 mmol/L；靈敏度為65.7 nA（mmol/L）－1； 檢出限為30

SymbolmA@ mol/L。此傳感器的制備和檢測不需要過氧化物酶及電子中介物，經濟、簡便且快速。

關鍵詞 膽堿傳感器; 光致電化學；聚硫堇；過氧化氫；膽堿

2010-10-14收稿；2010-12-31接受

本文系山東省自然科學基金（No.2009ZRB01393）和電分析化學國家重點實驗室開放基金資助

E-mail: zhaocz@qust.edu.cn

1 引 言

膽堿是一種有機堿，是乙酰膽堿的前體和卵磷脂的組成成分，也存在于神經鞘磷脂之中，在動物體內參與合成乙酰膽堿或組成磷脂酰膽堿等。它在調整動物體內脂肪代謝、控制膽固醇的積蓄、防止脂肪肝、保證體細胞的正常生命活動、促進軟骨發育以及神經系統的正常運行等方面都起著重要作用［1，2］。膽堿是一種季胺堿，沒有紫外吸收和電化學活性，所以利用酶的催化反應成為測定膽堿的重要方法。近年來，酶修飾的電流型膽堿生物傳感器已有較多的研究［3～8］，但該類傳感器都要使用過氧化物酶，借助于電子媒介物或納米材料。本研究將硫堇電聚合在光透電極的表面上，用戊二醛交聯膽堿氧化酶，制備了一種新型的膽堿生物傳感器。此傳感器利用聚硫堇光透電極同時具有光敏和電子受體的功能，與電子供體H2O2組成了一個新的光致電化學系統。利用膽堿氧化酶對膽堿的催化反應直接產生H2O2，檢測由此產生的光電流，進而實現對膽堿的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI 832B型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；導電玻璃（ITO，＜17 Ω/cm2，深圳南玻集團偉光公司）；以制備的修飾電極為工作電極，Ag/AgCl電極（3.0 mol/L KCl）為參比電極，鉑絲為對電極，組成三電極系統；TU1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；JSM-6700F型場發射掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）；LP-3B光功率計（北京物科光電技術有限公司）。自制光電化學池最大容積為5.0 mL，光源為50 W碘鎢燈，光源與光電化學池光窗的舊距為30 cm，由光閘控制激發光射入。

硫堇（Th， 99.8%）、膽堿氧化酶（ChOx， EC 1.1.3.17）、磷脂酶D（PLD， EC 1.1.4.4，日本和光制藥公司）；膽堿（Ch，上?；瘜W試劑有限公司）；磷脂酰膽堿（PC，99％，美國Sigma公司）。15% SnO2溶膠（Alfa Aesar公司）；用水稀釋至10%，備用。0.1 mol/L醋酸鹽（ABS）和磷酸鹽（PBS）緩沖溶液。殼聚糖（CS，脫乙酰度92%，大連新碟有限公司）；用ABS將其配制成1%溶液備用。H2O2儲備液由30% H2O2制備，用碘量法標定其準確濃度；

不同濃度的H2O2溶液由儲備液和緩沖溶液稀釋制備。其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水（＞17 MΩ cm）。

2.2 電極的制備

將ITO導電玻璃切成5.0 cm×1.0 cm長條，依次用乙醇、丙酮、水超聲清洗5 min，干燥。在一端留出1.0 cm作為電極端子，在另一段用絕緣漆封住，并在表面留出直徑為6.0 mm的空白作為ITO電極。將10% SnO2 溶膠均勻涂覆在ITO電極上，干燥后將其置于含有4.0 mmol/L Th溶液的電解池中。 在1.20 V電位沉積40 min后，制得聚硫堇膜電極（PThE）。用水清洗掉表面吸附的Th單體，再用PBS（pH 6.5）清洗，自然干燥后取5

SymbolmA@ L CS溶液滴在PThE表面，室溫下晾干成膜。取5

SymbolmA@ L 0.25%戊二醛滴在電極表面，室溫下反應30 min，用PBS（pH 6.5）溶液清洗干燥。滴加5

SymbolmA@ L 1.5 g/L ChOx溶液于電極表面上，室溫下反應2 h。晾干后再洗凈表面吸附的ChOx，即得聚硫堇/殼聚糖-酶電極（ChOx-CS/PThE）。

2.3 光電流響應的測量

在室溫將電解液置于光電化學池中，插入ChOx-CS/PThE，并使其工作表面對準光窗，分別連接三電極至電化學工作站。施加可見光作為激發光源，至光窗處的能量為15 mW/cm2。電化學工作站檢測光電流響應，偏壓設置為0.50 V。向電解池中注入樣品并同時啟動電流檢測，待催化反應8 min時，開啟光閘，每20 s切換1次，形成光電流-時間圖譜。

第6期趙常志等： 基于聚硫堇/過氧化氫光電化學敏感界面的膽堿傳感器

3 結果與討論

3.1 電極的表征

觀察PThE表面有藍色膜生成，掃描電鏡照片顯示聚硫堇（PTh）呈塊狀均勻分布于電極表面（圖1a）。PThE的循環伏安曲線（CV）顯示其有一對對稱的氧化還原峰，陽極和陰極峰電位分別為0.032和－0.045 V，

SymbolDA@ Ep＝77 mV， 圖1 聚硫堇膜（a）和聚硫堇/殼聚糖-酶（b）電極表面的掃描電鏡圖

Fig．1 SEM images of poly（thionine） （PThE）（a） and choline oxidase-chitosan （ChOx-CS）/PThE surface （b）式電位 E0′為－0.0065 V，與文獻［9］的酸性介質中PTh的電極反應一致，顯示PTh與Th

有相似的電化學活性。PThE對可見光的最大吸收位于605 nm處，與溶液中Th的598 nm非常接近，表明具有同樣吸收光的性質。ChOx-CS/PThE的CV與PThE的差別不大，峰電位向正電位略有移動，峰電流有所減小。觀察掃描電鏡照片（圖1b），有層狀蛋白質分布在電極表面。

3.2 傳感器對H2O2和Ch的光電流響應

ChOx-CS/PThE對H2O2的光電流響應如圖2所示，將光照交替開關3次，獲得3組光電流響應依次略微減小，但變化不大，說明ChOx-CS/PThE對光照的響應重現性較好。同時觀察到，光電流-時間曲線的電流值隨著H2O2濃度增加而逐漸增大。圖3內的插圖是ChOx-CS/PThE對Ch的光電流響應。在0.05～2.00 mmol/L濃度范圍可獲得線性響應（圖3），回歸方程為 i＝23.6＋65.7C，相關系數為0.9986，靈敏度Δi/CCh為65.7 nA（mmol/L）－1， 檢出限為30.0

SymbolmA@ mol/L。根據Lineweaver-Burk方程［10］，用雙倒數作圖法計算出的米氏常數KMa為0.947 mmol/L。

圖2 傳感器對H2O2的光電流響應

Fig．2 Photocurrent responses of sensor to H2O2

CH2O2 （1～10）: 0， 0.05， 0.10， 0.20， 0.40， 0.60， 0.80， 1.00， 1.50， 2.00 mmol/L．

圖3 傳感器對膽堿的光電流響應

Fig．3 Photocurrent responses of sensor to choline

CCh （1～10）: 0， 0.05， 0.10， 0.30， 0.50， 0.80， 1.00， 1.50， 2.00， 2.50 mmol/L．

3.3 光電界面對H2O2和Ch的光致電化學響應原理

Th可與Fe3＋/2＋在酸性介質中組成光電池［11］，Th與二茂鐵組成的光致電化學體系也已被用于DNA分析［12］。在酸性介質中， O2/H2O2的電極電位約為0.65 V，小于Fe3＋/Fe2＋的電極電位（0.77 V），氧化態的Th＋在光照激發下，其基態能級E0由－0.03 eV變至單重態能級E0－0 2.03 eV［13］，可以氧化H2O2，產生光致電化學效應。而激發態的Th＋*被電子供體H2O2還原，繼而其還原態Th在電極上又被氧化，再次參與光致電化學反應，從而不間斷地產生光電流。在底物Ch存在下，ChOx催化Ch生成電子供體H2O2，所以在不需要過氧化物酶的情況下可以簡單、靈敏、快速地測定Ch。

3.4 偏壓和激發光強度的影響

當H2O2將PTh光電界面的Th＋*還原后，回到基態的Th必須被氧化為Th＋才能再度吸收光能而成為激發態的Th＋*，再次與H2O2發生電子轉移反應，循環往復，從而產生不間斷的光電流。所以，需要在光電界面上施加一個合適的偏壓讓Th失去電子。雖然ChOx-CS/PThE的循環伏安曲線表明其陽極峰電位為0.032 V，但考慮到超電位和電路阻抗的影響，從實驗獲得一個合適的偏壓是較好的選擇。在相同濃度電子供體的存在下，當從0.10～0.50 V每隔0.10 V依次調高偏壓時，觀察到光電流隨之同步增大。當設定的偏壓＞0.50 V時，光電流強度沒有明顯的增加。因此，本研究將偏壓固定在0.50 V。由于Th＋吸收光能而生成Th＋*，激發光的強度對光電流的大小有較強的影響。保持其它實驗條件不變，改變光程，使到達光窗的光強分別為7.0， 9.0， 11， 13和15 mW/cm2，發現光電流隨光照的增強而顯著增加。鑒于飽和光電流與光強成正比，從而間接驗證了PThE與H2O2的反應為光致電化學反應。

3.5 電解液pH值的影響

不同pH值條件獲得的ChOx-CS/PThE線性掃描伏安曲線可知，在pH 5.5～7.5之間，峰電流iLSV隨pH值的增加而變化（見表1），在pH 6.5時最大，這可能與PTh和CS的性質有關。由于PTh的電化學氧化為加質子反應［14］，CS的pKa約為6.3，不帶正電荷的CS有利于H＋向ChOx-CS/PThE的遷移。光譜實驗顯示，PThE的吸光度在pH 5.5～7.5間差別很?。ū?，A605），在此范圍內ChOx-CS/PThE對光的吸收基本不受pH值 影響。在1.50 mmol/L Ch存在下，考察pH 5.5～7.5間ChOx-CS/PThE對Ch的光電流響應

（見表1，iphoto），發現最大的光電流響應出現在pH 6.5。雖然與伏安實驗的結果一致，但與ChOx在弱堿性具有最佳催化活性的性質不符。這可能是由于pH值對PTh電化學行為的影響［15］，以及反應中的協同效應導致了此結果。為了獲得較大的光電流響應，本研究控制電解質的pH值為6.5。

3.6 傳感器的重現性和穩定性

傳感器對膽堿的測定有較好的重現性。同一傳感器對濃度為1.0 mmol/L 膽堿溶液進行5次連續測定，RSD為4.7％。相同條件下制得的5個傳感器，RSD為5.9％。制備的傳感器避光保存在PBS的上方，經14 d內逐日測試發現，傳感器對膽堿的響應在95%～100%，而后響應緩慢下降，20 d后傳感器仍能保持原有響應的80%。

3.7 傳感器的應用研究

Ch在含有卵磷脂的商品中以PC的形式存在。PC可在PLD的作用下水解成游離的Ch，通過對Ch的檢測即可間接測定PLD中PC含量。樣品采用傳統的溶劑法，即利用PC不溶于丙酮溶于乙醇的性質，用丙酮和乙醇兩種溶劑從PLD中提取PC，將其水解成Ch后測定。準確稱取商品PLD顆粒500 mg，置于圓底燒瓶中，加入丙酮100 mL，電動攪拌器加熱攪拌一定時間后過濾，將濾出物真空干燥后用無水乙醇溶解。靜置一段時間后取上部清液加入PLD，35 ℃下攪拌15 min，以確保PC完全水解為Ch。將樣品試液用電解液稀釋，測定含量，并加入PC，進行回收實驗。傳感器對3種卵磷脂保健品的測定結果見表2， 結果令人滿意。

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Choline Biosensor Based on Poly（thionine）/H2O2

Photoelectrochemical Sensing Interface

ZHAO Chang-Zhi*， YU Jia， ZHAO Gai-Shuang， JIAO Kui

（College of Chemistry Molecular Engineering， Qingdao University of Science Technology， Qingdao 266042）

Abstract A new choline biosensor based on the chitosan immobilized choline oxidase on poly（thionine）-modified ITO electrode （PThE） was described. The photosensitive PThE was employed as an electron acceptor， and H2O2 produced by the catalytic reaction was employed as an electron donor. The photoelectrochemical responses of biosensor to H2O2 and choline were studied. The effects of bias voltage， light intensity and pH of electrolyte to photocurrent were investigated. The linear response of choline concentrations ranged from 0.05 to 2.00 mmol/L with a detection limit of 30.0

SymbolmA@ mol/L and sensitivity of 65.7 nA/mmol/L. The applied feasibility of the biosensor was acknowledged through monitoring the phosphatidylcholine in lecithin samples. The prepared biosensor is economical， speedy， simple and convenient to detect the choline without hydrogen peroxidase.

Keywords Choline biosensor; Photoelectrochemicamistry; Poly（thionine）; Hydrogen peroxide; Choline

（Received 14 October 2010; accepted 31 December 2010）