印跡聚合物改性多壁碳納米管固相萃取熊果酸

摘 要 以聚乙二醇改性的碳納米管為基質，熊果酸為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，偶氮二異丁腈為引發劑，采用沉淀聚合法成功制備碳納米管-印跡復合材料。采用紅外光譜和掃描電鏡研究該復合印跡材料的結構和形貌。結果表明，在碳納米管表面接枝一層穩定且均勻的印跡材料。采用靜態吸附實驗研究此印跡材料的吸附性能，此印跡材料對模板分子具有較大的表觀吸附容量（Qmax為100.1

SymbolmA@ mol/g）和良好的選擇吸附性能。以此印跡材料作為固相萃取材料，優化固相萃取條件，成功分離富集獼猴桃根提取液中熊果酸，富集因子為5.35。

關鍵詞 碳納米管； 印跡； 固相萃取； 熊果酸

2010-09-24收稿；2010-12-01接受

本文系國家自然科學基金（No. 21005030），湖南省教育廳重點項目（No. 10A099），湖南省科技計劃項目基金（No. 2009FJ3009）以及湖南省大學生創新基金 （No. JSU-CX-2010-46） 資助

 E-mail: zhaohuizhang77@163.com

1 引 言

熊果酸是一種三萜類化合物，具有鎮靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗潰瘍和降低血糖等多種功能［1，2］。研究發現，熊果酸能明顯抑制HL-60細胞增殖，并誘導其凋亡［3］。因此熊果酸有可能成為低毒有效的新型抗癌藥物。目前，熊果酸主要來自植物提取，然而其提取工藝操作繁瑣，耗費巨大，因此發展高效分離技術是植物資源活性成分提取工藝的必然趨勢。

近年來，固相萃取已成為分離純化的熱門研究技術［4］。固相萃取吸附劑是萃取分離純化工藝的關鍵因素，它的主要作用是從含量很低的復雜成分中分離并富集目標物，這要求萃取材料對目標物具有較強的選擇吸附能力。近年，結合分子印跡技術形成分子印跡-固相萃取聯合技術已成為固相萃取的重要研究方向［5，6］。該技術已成功應用于分離富集重金屬離子［7］，海洋污染物［8，9］及植物有效活性成分［10］。同時各種新型印跡萃取材料也不斷研制和開發，以碳納米管作吸附基質的新型復合印跡材料就是其中一種［11，12］。碳納米管表面很難直接修飾印跡聚合物，制備的印跡復合材料在固相萃取過程中由于吸附力不夠，萃取壓力過大而難以使用。目前，常用的碳納米管表面修飾方法是強酸羧化法。然而由于碳納米管在強酸氧化反應過程中，碳納米管的管壁結構遭到破壞，需要接枝其它聚合物彌補［13］。這種被接枝的聚合物有3種作用：彌補強酸破壞碳納米管管壁的結構；一定程度上解決碳納米管團聚現象，使碳納米管分散性更好；在一定范圍內增粗碳納米管，可略降低固相萃取時產生的高壓。

本研究以碳納米管為基材，通過聚乙二醇改性，制備碳納米管-印跡復合材料。結合液相色譜技術，詳細探討新型碳納米管-印跡符合材料固相萃取的條件，將碳納米管印跡-固相萃取技術成功用于富集獼猴桃根中的熊果酸。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC-2010AHT型高效液相色譜（日本島津公司）；757型紫外-可見分光光度計（上海精密科學儀器公司）；JSM-6700F電子掃描顯微鏡（日本電子公司）；紅外光譜儀（德國Bruker公司）。多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes， MWNT，直徑為30～50 nm，純度≥95%，深圳比爾科技公司）。

熊果酸（Ursolic acid，UA），齊墩果酸（Oleanic acid，OA）結構如圖1，購自上海萬代制藥有限公司；α-甲基丙烯酸（Methacrylic acid， MAA）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（Ethyleneglycol dimethacrylate， EGDMA）；偶氮二異丁腈（2，2′-Azobisisobutyronitrile， AIBN）購自美國Sigma公司；聚乙二醇2000（PEG），氯化亞砜（SOCl2）；N， N′-二甲基甲酰胺（N，N′-dimethylformamide， DMF）；甲苯，乙醇，HCl，NaOH，乙酸，甲醇（色譜純，長沙化學試劑公司）；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。獼猴桃根產自湖南吉首。 圖1 熊果酸和齊墩果酸的化學結構式

Fig．1 Chemical structures of ursolic acid and oleanolic acid

2.2 碳納米管表面修飾

取0.5 g MWNTs分散于30 mL甲苯中，超聲10 min，在連續攪拌下加入0.1 g AIBN。通氮除氧30 min后，75 ℃反應4 h。反應產物以甲苯洗滌4次，40 ℃真空干燥過夜，得到黑色的AIBN改性碳納米管粉末。取0.5 g AIBN改性碳納米管分散于50 mL NaOH甲醇溶液（10 mol/L）中，60 ℃回流48 h，反應結束后，過濾分離反應液，固體產物先用1 mol/L HCl調至pH 3，再用去離子水洗滌至中性，在40 ℃真空干燥12 h，得到黑色羧基改性的碳納米管（MWNT/COOH）。

取0.5 g MWNT/COOH加入到50 mL SOCI2和2 mL DMF的混合溶液中，70 ℃攪拌回流24 h。反應完成后，減壓蒸餾出未反應的SOCl2。接著加入50 mL DMF和5 g PEG，超聲溶解后置于120 ℃下攪拌回流48 h。過濾，濾餅用乙醇洗滌5次。在80 ℃下將產物烘干， 得到聚乙二醇改性碳納米管（MWNT/PEG）。

第6期劉 曦等： 印跡聚合物改性多壁碳納米管固相萃取熊果酸

2.3 碳納米管印跡材料制備

按表1配比合成碳納米管印跡固相萃取材料。稱取MWNT/PEG、UA和MAA混合至50 mL乙腈中，超聲溶解分散后靜置1 h。然后加入交聯劑EGDMA和引發劑AIBN，再通氮除氧15 min后，密封，置于恒溫水浴箱60 ℃下聚合24 h。反應結束后，固體產物冷卻至室溫，用20%（V/V）乙酸-甲醇溶液超聲洗脫模板分子，再用去離子水洗脫乙酸和甲醇，收集產物于烘箱中80 ℃干燥，得到碳納米管印跡材料（MWNT/MIPs）。不加模板分子，以同樣方法制備非印跡碳納米管復合材料（MWNT/NIPs）用于對照分析。

30 UA: Ursolic acid; MAA: Methacrylic acid; EGDMA: Ethylene glycol dimethacrylate; AIBN: 2，2′-azobisisobutyronitrile; PEG: Polyethylene glycol.

2.4 印跡材料吸附性能

稱取一系列10 mg MWNT/MIPs于吸附管中，分別加入10 mL 0.1～1.0 mmol/L UA乙醇溶液，連續振蕩吸附6 h，用紫外-可見分光光度計在210 nm處測定吸附后UA的濃度。根據吸附前后濃度差計算MWNT/MIPs對UA的吸附量。

2.5 印跡固相萃取

稱取300 mg MWNT/MIPs，按照文獻［5］填柱方法裝入100 mm×10 mm固相萃取柱中，兩端用玻璃棉封堵。為探討溫度對萃取的影響，固相萃取于20和40 ℃兩個溫度下進行。具體步驟如下：填充柱用1 mL甲醇清洗，再用1 mL蒸餾水清洗。上樣1.0 mL 0.1 mmol/L UA乙醇溶液，打開真空泵，控制流速為1.0 mL/min，以10 mL不同比例的乙醇與乙酸的混合溶液作為洗脫溶液，探討并優化實驗條件。所有洗液（包括淋洗液和洗脫液）經過重新定容至10 mL，采用高效液相色譜（HPLC）測定UA濃度，根據加入標準UA量計算回收率。

取2.0 g干燥過80目篩的獼猴桃根粉末（粒徑＜0.18 mm）， 浸入50 mL乙醇中，超聲提取15 min。懸浮液用0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾，收集濾液以乙醇定容至50 mL。取1.0 mL提取液，采用上述“上樣-淋洗-洗脫”的步驟進行固相萃取。用5%（V/V）乙酸-乙醇溶液淋洗除去非印跡吸附的干擾物質，再用25%（V/V）乙酸-乙醇溶液作為洗脫液，測試所制備的印跡固相萃取材料的應用效果。

色譜條件： VP-ODS C18色譜柱 （150 mm×4.6 mm），柱溫為30 ℃，流動相為甲醇-6 mmol/L pH 5.4磷酸鹽緩沖溶液 （85∶15， V/V），流速為1.0 mL/min，紫外檢測波長為210 nm。

3 結果與討論

3.1 MWNT/MIPs制備

MWNT中的碳原子相互之間以CC鍵結合起來，形成六邊形的蜂窩狀結構。每個碳原子上未參與雜化的一對p電子相互之間形成跨越整個MWNT的共軛p電子云。MWNT的共軛p電子云對含電子云密集的環類化合物具有較強的吸引力，這是選擇MWNT作為載體制備UA的印跡材料的主要原因。傳統的強酸氧化可以在MWNT表面或者端基產生羧基，再通過其它方法可完成在MWNT表面接枝其它聚合物。這種方法程序簡單，但經過強酸氧化后，MWNT容易被截得很短小［13］，制備的印跡固相萃取材料在使用時柱壓過大，不利于固相萃取操作。

為解決固相萃取過程中柱壓過大問題，本研究對MWNT接枝大量的碳鏈“支架”，使印跡聚合修飾的固相萃取材料能夠在“支架”的作用下變得粗大。MWNT/MIPs合成過程如圖2所示。這種“支架”結構既不影響碳納米管的吸附，圖2 MWNT/MIPs合成示意圖

Fig．2 Preparation procedure for MWNT/MIPs又可以支撐MIPs，從而改善固相萃取過程中柱壓過高的難題。選取PEG作為“支架”，這是因為PEG具有足夠長的碳鏈結構，能夠滿足改性需要，更重要的是PEG結構中具有大量COC，COC能夠產生氫鍵，有利于印跡固相萃取材料吸附模板分子［14］。 圖3 MWNT，MWNT/PEG和MWNT/MIPs的紅外光譜

Fig．3 IR spectra of MWNT， MWNT/PEG and MWNT/MIPs

3.2 印亦材料的紅外分析和形貌分析

圖3為原始MWNT， MWNT/PEG和MWNT/MIPs的紅外光譜圖。原始MWNT的紅外光譜圖的吸收峰最少，這是因為MWNT僅含有較簡單的有機結構，紅外光譜吸收較少。MWNT/PEG和MWNT/MIPs在3600～3000 cm－1有較寬的彌散吸收峰，這是OH和CH吸收峰疊加導致的。在1500～1800 cm－1處是CO吸收峰。此外，1000～1270 cm－1處是COC的伸縮振動峰；2800～3000 cm－1處是CH3的特征峰；800～1000 cm－1處是（CH2）n的搖擺振動峰，這3處吸收峰是印跡材料的特征吸收峰。

采用掃描電子顯微鏡觀察MWNT，MWNT/PEG和MWNT-MIP的表面形貌，結果如圖4所示。MWNT呈單一的納米管狀或小的束狀；同樣放大100000倍下，MWNT/PEG和MWNT/MIP已經均勻變粗，這表明聚乙二醇已經成功均勻地包覆在MWNT表面。相對于MWNT/PEG，MWNT/MIP1與MWNT/MIP2兩種印跡材料中碳納米管都不同程度地變粗，MIP接枝比例大的MWNT/MIP2的管徑大于MWNT/MIPs1的管徑。

3.3 MWNT/MIPs吸附性能

3.3.1 等溫吸附 采用靜態平衡吸附實驗研究復合印跡材料對UA的吸附性能。圖5a為復合印跡材料對UA的吸附等溫線。MWNT/MIPs和MWNT/NIPs的吸附量隨UA濃度的增加而增加。當UA濃度大于0.8 mmol/L時，MWNT/MIPs2吸附曲線變得相對平滑，吸附達到飽和；UA濃度大于0.6 mmol/L時，MWNT/MIPs1吸附已達到飽和，但吸附量比MWNT/MIPs2小；這可能由于MWNT/MIPs2印跡空穴數量比MWNT/MIPs1多。本研究選擇MWNT/MIP2作為實驗材料。MWNT/NIPs對UA也有吸附，但與MWNT/MIPs相比，吸附容量小得多，這是因為MWNT/NIPs不具備在預聚合階段形成的三維印跡空穴。

圖4 MWNT （a），MWNT/PEG （b）， MWNT/MIPs1 （c）和MWNT/MIPs2 （d）的電鏡圖

Fig．4 SEM images of MWNT （a）， MWNT/PEG （b）， MWNT/MIPs1 （c） and MWNT/MIPs2 （d）

以MWNT/MIPs2對UA的等溫靜態吸附數據進行Scatchard模型［15］分析，Scatchard方程為：

QC＝QmaxK－QK

式中，Q（

SymbolmA@ mol/L）和Qmax（

SymbolmA@ mol/L）分別是MWNT/MIPs對UA的吸附量和最大表觀吸附量，C（mmol/L）是吸附平衡時UA的濃度，K（mmol/L）是接合位點的平衡解離常數。以Q/C對Q作圖可得到圖5b。圖5b中明顯有呈線性關系的兩個部分，表明MWNT/MIPs2在UA研究濃度內（0.1～1.0 mmol/L）存在兩種吸附結合位點。分別對兩部分進行擬合，根據直線斜率和截距可以求得高親和位點解離常數K1＝1.37 mmol/L，最大表觀結合量Qmax1＝24.8

SymbolmA@ mol/g；低親和位點解離常數K2＝15.87 mmol/L，最大表觀結合量Qmax2＝75.3

SymbolmA@ mol/g。所以，MWNT-MIPs對UA的理論最大表現吸附量Qmax＝100.1

SymbolmA@ mol/g。

圖5 MWNT/MIPs和MWNT/NIPs對UA的吸附等溫線（a）；MWNT/MIPs2對UA吸附的Scatchard模型擬合曲線（b）

Fig．5 Adsorption isotherms of ursolic acid （UA） on MWNT/MIPs and MWNT/NIPs （a）， and linearized according to Scatchard model （b）

3.3.2 選擇吸附性能 用平衡吸附法測定類似UA結構的齊墩果酸（OA）在MWNT/MIPs2和MWNT/NIPs上的吸附容量，考察MWNT/MIPs2的特異選擇性。具體操作如下：取10 mg MWNT/MIPs和MWNT/NIPs各2份，分別置于1.0 mmol/L 的UA和OA乙醇溶液中，其它實驗條件與吸附等溫線實驗一致。圖6為MWNT/MIPs2和MWNT/NIPs對UA特異選擇吸附結果。MWNT/MIPs2對UA有較高的吸附容量，而對OA的吸附容量則較低。在相同條件下，MWNT/NIPs對UA和OA的吸附容量均較小，這表明MIPs層所具有的對模板分子結構對應的印跡孔穴對吸附起選擇作用。選擇性能通常以印跡因子α和選擇因子β表示，其定義如下［16， 17］：

α＝QMIPsQNIPs， β＝αtemαana

式中，QMIPs和QNIPs分別為印跡材料和非印跡材料對模板UA的吸附容量，αtem和αana分別是模板UA和結構相似物OA的印跡因子。經計算可知，MWNT/MIPs2的印跡因子α＝2.76；選擇因子β＝2.88。

3.4 固相萃取條件優化

3.4.1 流速和壓力影響

參照文獻［5］制作MWNT/MIPs固相萃取柱，并依次進行上樣、淋洗和洗脫等步驟。在固相萃取過程中，樣品液、淋洗液和洗脫液均將以一定的速率流經固相萃取柱，故速率將影響固定相對流動相中目標物的保留［18］。同時，速率也是改變固相萃取柱壓力的重要因素，壓力過大會嚴重影響固相萃取柱的壽命和萃取操作的難度。按照文獻［19］操作，以5%乙酸乙醇溶液為淋洗液，利用真空泵控制流速，測試壓力和流速之間的關系，結果見圖7。MWNT/MIPs1填充柱淋洗液以1.5 mL/min 淋洗時，壓力已達到38 MPa。而MWNT/MIPs2柱在流速為3.0 mL/min時，壓力達38 MPa。所以，流速變化對MWNT/MIPs2柱柱壓影響小。對MWNT/MIPs2柱而言，1.0 mL/min是一個較為理想的流速，此時壓力為14.2 MPa。因此本研究選取1.0 mL/min作為所有固相萃取時的流速。

圖6 MWNT/MIPs2對UA和OA選擇吸附容量

Fig．6 Selective adsorption capacities of UA and pleanic acid （OA） on MWNT/MIPs2

圖7 洗脫溶液流速對壓力的影響

Fig．7 Effect of different flow rates on backpressure

3.4.2 洗脫溶劑優化 本研究選擇極性較大的乙酸-乙醇混合溶劑作為淋洗液和洗脫液［20］。在加標固相萃取實驗中，采用10 mL不同乙酸含量的乙醇溶液作為洗脫液，根據加標回收率探討洗脫液的洗脫能力。實驗發現，對于MWNT/MIPs柱，乙酸含量越高的溶液對UA的洗脫能力越強。15%～25%的乙酸-乙醇洗脫回收率達到85%以上； 10%乙酸-乙醇的洗脫回收率為74.3%，5%乙酸-乙醇的洗脫回收率為44.3%。而超過25%的乙酸-乙醇的洗脫效果增加不明顯，因此選擇5%乙酸-乙醇溶液作為淋洗液，25%乙酸-乙醇溶液作為洗脫液。

3.4.3 固相萃取溫度優化 分別于20和40 ℃下進行固相萃取，圖8是不同溫度下固相萃取液的色譜圖。在其它條件相同時，低溫（20 ℃）萃取時的UA色譜峰高明顯高于高溫（40 ℃）萃取時的峰高，這表明MWNT/MIPs2在低溫下有利于對UA的保留。另外，在高溫（40 ℃）時，淋洗液色譜峰數目多，這表明MWNT/MIPs在高溫下對樣品中成分（包括目標物UA）的吸附作用力減小，淋洗更容易。計算可知，在20 ℃ 時萃取獼猴桃根中熊果酸的濃度由0.24 mg/L富集到0.31 mg/L。在40 ℃萃取時，熊果酸的濃度卻降低為0.09 mg/L。本研究中固相萃取溫度選擇20 ℃。

圖8 MWNT/MIPs2在20 ℃ （a）和40 ℃ （b）下固相萃取獼猴桃根提取液中熊果酸色譜圖

Fig．8 Chromatograms of actinidia root extract through MWNT/MIPs2 SPE at 20 ℃ （a） and 40 ℃ （b）

1. 獼猴桃根提取液（Actinidia root extract）； 2. 淋洗液（Washing solution）； 3. 洗脫液（Eluting solution）； UA: 熊果酸

3.4.4 實際樣品的固相萃取 在20 ℃下對獼猴桃根提取液中添加的UA進行固相萃取。實驗表明，獼猴桃根樣品中UA添加含量為14.9%，經固相萃取操作后洗脫液的含量為79.7%，UA得到有效純化和分離，富集因子為5.4。

以熊果酸為模板分子，在聚乙二醇改性多壁碳納米管表面成功制備對熊果酸具有較強選擇識別吸附能力的MWNT/MIPs。結果表明，此復合印跡材料具有較穩定的化學結構及較好的選擇識別吸附能力。MWNT/MIPs對UA有兩種結合位點，總表觀結合量為100.1

SymbolmA@ mol/g。以MWNT/MIPs為固相萃取材料，萃取獼猴桃根中UA，優化固相萃取條件，UA得到有效富集。

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Solid Phase Extraction of Ursolic Acid Using Imprinted Polymer

Modified Multi-walled Carbon Nanotubes

LIU Xi1， ZHANG Zhao-Hui*1，2， ZHANG Hua-Bin1， HU Yu-Fang1， YANG Xiao1， NIE Li-Hua2

1（College of Chemistry and Chemical Engineering， Jishou University， Jishou 416000）

2（State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics， Hunan University， Changsha 410082）

Abstract A novel surface imprinting material based on multi-wall carbon nanotubes（MWNT/MIPs） modified with polyethylene glycol was successfully synthesized with a precipitation polymerization method by using ursolic acid（UA） as template， methacrylic acid（MAA） as functional monomer， and ethylene glycol dimethacrylate（EGDMA） as cross-linker. The MWNT/MIP was characterized by IR and scanning electron microscopy（SEM）. The results showed that a stable， uniform imprinted materials layer was grafted on the surface of MWNT. The adsorption capacity of UA on MWNT/MIPs was measured by high performance liquid chromatography. A maximum apparent adsorption capacity of 100.1

SymbolmA@ mol/g for the imprinted polymers toward UA was obtained. As solid phase extraction materials， the imprinted polymers extracted UA from actinidia chinensis planch successfully with the concentration enrichment factor of 5.35.

Keywords Multi-walled carbon nanotubes; Imprinting; Solid phase extraction; Ursolic acid

（Received 24 September 2010; accepted 1 December 2010）