超高效液相色譜-串聯質譜法測定草魚肉中阿苯達唑及其代謝物殘留

摘 要 建立了同時測定草魚肉中阿苯達唑及其3種代謝物阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）分析方法。草魚肉樣品通過堿性乙酸乙酯提取，正己烷凈化，超高效液相色譜分離，串聯質譜檢測，氘代同位素內標定量。本方法分析時間短，在4 min內即可完成4種被分析物的液質聯用分析。本方法在0.1～10

SymbolmA@ g/kg范圍內各物質線性良好，線性系數在0.9991～0.9996之間。阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜在0.5～5.0

SymbolmA@ g/kg添加水平下的平均回收率分別為98.4%～102.6%， 97.1%～103.4%， 98.8%～103.7%和101.1%～104.2%檢出限分別為0.2， 0.1， 0.2 和0.1

SymbolmA@ g/kg；日內精密度小于4.77%，日間精密度小于3.03%。本方法為阿苯達唑及其代謝物的檢測及監控提供了一種快速、靈敏度高、重現性好的定量分析方法。

關鍵詞 超高效液相色譜-串聯質譜； 阿苯達唑； 草魚

2010-10-11收稿；2011-01-24接受

本文系浙江省水產加工產業創新團隊項目（No.2011R09031-15）和浙江省重大科技專項項目（No.2008C02013）資助

 E-mail:xiaojun3627@163.com

1 引 言

阿苯達唑是一種苯并咪唑類藥物，其化學名稱為5-丙硫基苯異咪唑-2-氨基甲酸甲酯。阿苯達唑在國內作為漁藥常用于驅除魚類腸道寄生蟲，治療草魚、鯽魚等魚類的絳蟲、毛細線蟲、棘頭蟲等寄生蟲疾病。阿苯達唑在動物體內不穩定，會在較短時間內代謝為阿苯達唑亞砜（ABZSO）、阿苯達唑砜(ABZSO2)、阿苯達唑-2-氨基砜(ABZ-2NH2-SO2)［1］。阿苯噠唑及其代謝物的結構如圖1所示。文獻［2］研究表明，動物給藥后4～10 d內，阿苯達唑殘留只有20%～30%，其它殘留則以上述3種代謝物形式存在。代謝物的性質給阿苯達唑及其代謝物的檢測帶來了較大的難度。目前，對養殖用漁藥的使用管理的日益加強，對其進行代謝和風險評估也更為重視。毒理學研究表明，阿苯達唑及其活性代謝物阿苯達唑亞砜具有致畸作用［3］。為進一步研究阿苯達唑在水產品體內的代謝規律和保證水產品質量安全，有必要建立一種快速、準確定量分析阿苯達唑及其代謝物的測定方法，以適應科研和水產品質量安全檢測需要。

檢測阿苯達唑常用方法主要有高效液相色譜法［4～7］和高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS）［8～11］等。高效液相色譜法靈敏度相對較低，且需要用到離子對試劑作為流動相［5，6］。HPLC-MS方法靈敏度較高，但主要用于動物血漿中阿苯達唑的檢測，用于動物肌肉組織的方法較少。同位素內標定量作為一種質譜分析常用的方法，可有效提高方法回收率、精密度及定量準確度等。本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）對草魚肉中阿苯達唑及其3種代謝物進行快速色譜分離和準確定性分析，利用氘代同位素內標進行準確定量分析，可防止在測定過程中因阿苯達唑代謝降解帶來的定量偏差。本研究可為阿苯達唑及其代謝物的檢測及監控提供一種快速準確、靈敏度高、重現性好的定量分析方法。

圖1 阿苯噠唑及其代謝物的結構圖

Fig．1 Structures of albendazole (ABZ) and its metabolites

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、QUATTRO Premier XE串聯四極桿質譜儀，（美國waters公司）；T18勻漿機、MS2漩渦混合器（德國IKA公司）； Centrifuge 5810高速離心機（Eppendorf公司）；N-EVAP112氮吹儀（Organomation公司）；R-215 旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司）

實驗用水為Milli-Q制備高純水；甲醇、甲酸、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純（Merk公司）；NaOH（分析純，上海試劑集團）；阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜、氘代阿苯達唑(D3-ABZ)、氘代阿苯達唑砜（D3-ABZSO2）標準品的純度＞98%（德國Dr公司）；其它試劑均為分析純。

2.2 標準溶液配制

2.2.1 ABZ及其代謝物標準儲備液和標準工作液 分別準確稱取4種標準品各10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，分別配成濃度均為100 mg/L的4種標準儲備液。避光冷藏保存，保存期為3個月。用甲醇將4種標準儲備液分別逐級稀釋成所需的混合標準工作液，現配現用。

2.2.2 氘代內標工作液 取D3-ABZ和D3-ABZSO2標準物質分別用甲醇配制100 mg/L標準儲備液，取內標儲備液用甲醇配成100

SymbolmA@ g/L 混合內標工作液。

2.3 樣品的制備

稱取（2±0.02）g 充分勻漿的樣品置于50 mL離心管中，加入100

SymbolmA@ L 100

SymbolmA@ g/L內標工作液混勻。向離心管中加入15 mL 乙酸乙酯溶液和100

SymbolmA@ L 2 mol/L NaOH溶液，漩渦混合提取10 min， 以6000 r/min 離心5 min，收集上清液轉移至100 mL雞心瓶中，樣品殘渣用15 mL 乙酸乙酯溶液重復提取一次，合并上清液。上清液于40 ℃旋轉蒸發至干，向雞心瓶中加1 mL甲醇-水溶液（4∶6， V/V）超聲1 min以溶解殘渣。將雞心瓶中溶液轉移至10 mL 離心管中，加2 mL 正己烷渦旋混合2 min，以6000 r/min離心 5min，取水相溶液過0.22

SymbolmA@ m 濾膜后待測。

2.4 色譜-質譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7

SymbolmA@ m）。流動相：A 為0.2%甲酸，B為甲醇。梯度洗脫：0～2.0 min， 90%～10% A; 2.0～3.0 min， 10% A; 3.0～4.0 min， 10%～90% A。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10

SymbolmA@ L。

第6期張小軍等： 超高效液相色譜-串聯質譜法測定草魚肉中阿苯達唑及其代謝物殘留

20  定量子離子（Quantitative ions）； ABZSO: Albendazole sulfoxide; ABZSO2: Albendazole sulfone; ABZ-2NH2- SO2: Albendazole aminosulfone。

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI＋)；檢測方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：380 ℃；錐孔氣流量：50 L/h；脫溶劑氣流量：600 L/h；目標物目標物母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量等質譜多反應監測實驗條件如表1所示。阿苯達唑以D3-ABZ為內標參照物，阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜以D3-ABZSO2為內標參照物，阿苯達唑及其代謝物的含量按照內標法由MASSLYNX軟件自動計算。

3 結果與討論

3.1 前處理方法選擇

阿苯達唑在動物體內可代謝為阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑-2-氨基砜，各代謝物的結構、性質有顯著差異，因此需要找出合適的提取方法。通過對甲醇、乙酸乙酯、乙腈、K2CO3等提取劑的比較發現，乙酸乙酯對4種物質均有較好的提取效果。阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑2-氨基砜在不同pH值的溶液中的電離度不同。選擇在pH 5.0、7.0和9.0條件下進行提取實驗。結果表明，在乙酸乙酯提取劑中加入100

SymbolmA@ L 2 mol/L NaOH，使提取液呈堿性（pH 9.0），在該條件下阿苯達唑及其3種代謝物均有較高的回收率。按照實驗方法提取、凈化的供試溶液每12 h測定一次，以評估供試溶液的穩定性。結果表明，阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜在48 h內測定值相對穩定，阿苯達唑-2-氨基砜在24 h內相對穩定，各組分與理論濃度相比， 偏差均小于5%。

3.2 質譜條件選擇

以1.0 mg/L的標準品溶液蠕動泵進樣選擇被測物的母離子和子離子，并對錐孔電壓、碰撞電壓、毛細管電壓等質譜參數進行優化。在母離子掃描模式下，選擇母離子強度最大的錐孔電壓為最佳的錐孔電壓。在子離子掃描模式下，選擇強度最高的兩個子離子作為定性與定量子離子，同時選擇子離子強度最高時的碰撞能量為最佳的碰撞能量。ABZ及其3種代謝物的子離子掃描質譜圖如圖2所示。經實驗分析比較，ABZ及其3種代謝物的最佳母離子、子離子及電離條件、碰撞條件如表1所示。

圖2 阿苯達唑及其代謝物的子離子掃描圖

Fig．2 Daught scan spectra of ABZ and its metabolites

（A）阿苯達唑（ABZ）；（B）阿苯達唑亞砜（ABSO）；（C）阿苯達唑砜（ABSO2）；（D）阿苯達唑-2-氨基砜（ABZ-2NH2-SO2）。

3.3 阿苯達唑及其代謝物的色譜分離

采用甲醇和甲酸溶液作為流動相時，阿苯達唑及其代謝物有較好的峰型和響應值。在用等度洗脫時，由于阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜結構極為相似，二者不能完全分離。采用2.4節所示梯度進行洗脫，可將阿苯達唑及其3種代謝物完全分離，且出峰時間明顯縮短，可在4 min內完成色譜分析。與普通高效液相色譜分離用時10～35 min［4～12］相比，分析時間明顯縮短。阿苯達唑及其3種代謝物的標準溶液質譜離子流圖如圖3所示，4種物質峰型尖銳對稱，響應值和出峰時間均較為理想。

3.4 線性范圍和檢出限

用ABZ標準使用液配制濃度分別為0.05～10

SymbolmA@ g/L的標準工作溶液，進樣后制作標準曲線，計算線性方程，線性相關性及線性范圍。將空白樣品加標液逐級稀釋，取信噪比S/N＝3的樣品濃度為方法檢出限（LOD），取信噪比S/N＝10的樣品濃度為方法定量限(LOQ)。方法的線性范圍及檢出限見表2。結果表明，阿苯達唑及其代謝物在各自線性范圍內具有良好的線性相關性，方法檢出限和定量限均可滿足實際檢測的需要。

3.5 方法回收率、精密度和特異性

在草魚肉樣品中進行3個濃度水平（0.5， 1.0和5.0

SymbolmA@ g/kg）的加標回收實驗，計算其回收率和精密度。日間精密度采用1.0

SymbolmA@ g/kg添加水平連續測定5 d，計算日間精密度。回收率和精密度結果如表3所示。4種物質的平均回收率在97.1%～104.2%之間，日內精密度均小于4.6%，日間精密度均小于3.0%。本方法的回收率顯著高于目前已有的質譜分析方法(53%～77%［8］， 87.2%～91.1%［10］)。草魚肉樣品的基質效應采用空白樣品提取液加標的方法進行評估。通過空白草魚肉樣品的提取液與空白提取液加標

SymbolmA@ g/kg的色譜圖進行比較，各目標成分的偏差均小于10%，表明本方法的樣品基質效應對方法的影響并不明顯。此外，通過空白樣品色譜圖、空白加標樣品色譜圖與標準溶液色譜圖相比，草魚肉空白樣品色譜圖在目標物附近沒有發現明顯的雜峰，加標樣品的色譜圖與標準溶液色譜圖相似，沒有明顯的基質干擾。以上結果表明，本方法基質干擾小，重現性和精密度均可滿足藥物殘留分析的要求。

3.6 實際樣品檢測

在實驗室內養殖的草魚人工給藥2 d后，利用本方法可檢出阿苯達唑及其3種代謝物。利用本方法對舟山水產品市場上隨機購得的草魚100條進行檢測，其中1個樣品呈陽性，阿苯達唑原藥未檢出，阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑-2-氨基砜含量分別為0.47， 1.31和1.16

SymbolmA@ g/kg。

4 結 論

建立了同時測定草魚肉中阿苯達唑及其3種代謝物（阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜）的超高效液相色譜-串聯質譜（UHPLC-MS/MS）分析方法。草魚肉樣品中阿苯達唑及其代謝物通過堿性乙酸乙酯提取，正己烷凈化，獲得了較好的提取效果；本方法顯著縮短了色譜分析時間；采用串聯四級桿質譜檢測，結果準確；利用氘代同位素內標定量，提高了方法回收率和重現性，為阿苯達唑及其代謝物的檢測及監控提供一種快速準確、靈敏度高、重現性好的定量分析方法。

References

1 Nathan R， Badar S. J. AOAC Int.， 1996， 79 (3) : 645～651

2 European Agency for the Evaluation of Medicinal Products， EMEA/MRL/247/97-FINAL， Albendazole Summary Report. 1997

3 Delatour P， Parish R. Benzimidazole Anthelmintics and Relate Dcompounds: Toxicity and Evaluation of Residues In Drug Residues in Animals. Orlando: Academic Press， 1986: 175～204

4 Badar S， Nathan R.J. Agric. Food Chem.， 2003， 51(11): 3254～3259

5 Dimitrios J， Elias P. J. Agric. Food Chem.， 2005， 53(4): 893～898

6 YU Hui-Juan， HUI Yun-Hua， HUANG Dong-Mei， GU Run-Run， WANG Yuan（于慧娟，惠蕓華，黃冬梅，顧潤潤，王 媛）. J. Anal. Sci（分析科學學報）， 2008， 24(6): 673～676

7 Georgios C， Georgios A.J. Chromatogr. B， 2004， 805(2): 267～274

8 Chen X， Zhao L， Xu H， Zhong D. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2004， 35(4): 829～836

9 Pierina S， Anderson R， Fernando J， Bruno J， Vera L， Armando E， Hector H， Osvaldo M. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2007， 44(2): 558～563

10 Pierina S， Vera L， Osvaldo M. J. Chromatogr. B， 2003， 783(1): 237～245

11 Titus A， Mathew M. Talanta， 2006， 69(1): 243～250

12 DU Hong-Ge， TAN Xu-Xin， FANG Zhong-Yi， ZHU Hong-Ji（杜紅鴿， 譚旭信， 方忠意， 朱紅繼）. Chinese J. Vet. Med. （中國獸藥雜志）， 2010， 44(1): 52～55

Determination of Albendzole and Its Metabolites in Grass Carp Meat by

Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xiao-Jun1，2， ZHENG Bin3 ， ZHANG Hong2， YU Hai-Xia4， CHEN Xue-Chang2，

GUO Yuan-Ming1， MEI Guang-Ming2

1(Marine Fisheries Research lnstitute of Zhejiang Province， Zhejiang province

Key Lab of Mariculture Enhancement， Zhoushan 316100)

2(School of Food Science and Biotechnology， Zhejiang Gongshang University， Hangzhou 310035)

3(Zhejiang Marine Development Research Institute， Zhoushan 316100)

4(Zhejiang University Zhoushan Ocean Research Institute， Zhoushan 316000)

Abstract A method of ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) has been developed for the determination of albendzole(ABZ) and its metabolites， albendazole sulfoxide(ABZSO)， albendazole sulfone(ABZSO2) and albendazole aminosulfone(ABZ-2-NH2SO2) in grass carp meat. The samples were extracted with alkaline ethyl acetate and cleaned up by n-hexane. Chromatographic separation was achieved by UPLC and the detection was performed by tandem mass spectrometry using deuterated isotope internal standard. The UPLC-MS/MS analysis was rapid and can be achieved in less than 4 min. In the range of 0.1－10

SymbolmA@ g/kg， the analytes were in good linearity， and the correlation coefficients were 0.9991－0.9996. The recoveries of ABZ， ABZSO， ABZSO2 and ABZ-2-NH2SO2 spiked at levels of 0.5－5.0

SymbolmA@ g/kg， were 98.4%－102.6%， 97.1%－103.4%， 98.8%－103.7%， 101.1%－104.2%， the limit of quantity (LOQ ) were 0.2， 0.1， 0.2， 0.1

SymbolmA@ g/kg， respectively. The Intra-day RSD were less than 4.8%， and Inter-day RSD was less than 3.0%. The UHPLC-MS/MS method is rapid， sensitive， reproducible and suitable for the determination of ABZ and its metabolites

Keywords Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Albendzole; Grass carp

(Received 11 October 2010; accepted 24 January 2011)