蟲草素對胰腺癌BxPc-3、BxPc3-LN5細(xì)胞株增殖抑制作用的研究*

許文彥 龍江 唐亮 吳明生 張倩 倪泉興 虞先濬

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，上海200032；2.上海國寶企業(yè)發(fā)展中心，上海200001）

胰腺癌是一種較常見的惡性腫瘤。在我國胰腺癌的發(fā)病率也有逐年增多趨勢，90%的患者在診斷后1年內(nèi)死亡，1年生存率僅為1%～3%。藥物治療是重要的治療手段之一，它能明顯延長患者的生存時間，提高患者的生存質(zhì)量。蟲草素即3-脫氧腺苷（3-deoxyadenosine），為含氮配糖體的核酸衍生物，屬嘌呤類生物堿，是一種核苷類抗生素，最早由Cunningham于1951年在蛹蟲草（Cordyceps militaris）原漿液中分離得到，該成分后被證實(shí)為我國中草藥冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）的有效成分[1]。分子式為C10H13N5O3，相對分子質(zhì)量為251，熔點(diǎn)為230～231℃，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波長為259nm[2]。研究證明蟲草素能抑制mRNA合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]，使細(xì)胞分化，從而對多種腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用[4-9]。本文采用四甲基噻唑藍(lán)比色法（MTT比色法）研究蟲草素對胰腺癌細(xì)胞株BxPc3、BxPc3-LN5的生長抑制作用，為蟲草素是否可用于胰腺癌臨床化療進(jìn)行理論探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人胰腺癌細(xì)胞株BxPc3購買自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫中心。BxPc3-LN5是人原位胰腺腺癌細(xì)胞BxPc3在裸鼠體內(nèi)多次細(xì)胞注射成瘤后取裸鼠轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)原代培養(yǎng)所得。所有細(xì)胞株在含有10%胎牛血清的RPMI Medium 1640（RPMI 1640）+Dulbecco’s modified Eagle Medium（DMEM）各半的培養(yǎng)基中（pH7.2），并置于37℃、飽和濕度和5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。

1.2 藥物

四甲基噻唑藍(lán)（MTT）、DMSO購買自Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基、血清購自Hyclone公司；蟲草素來自上海國寶企業(yè)發(fā)展中心，純度為99.9%。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的人胰腺癌細(xì)胞株BxPc3、BxPc3-LN5從液氮罐中取出。細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇及傳代。取對數(shù)生長期的BxPc3、BxPc3-LN5細(xì)胞株，配制成1×107/mL單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1mL。

1.4 MTT檢測

實(shí)驗(yàn)組分別加入蟲草素至培養(yǎng)孔中，質(zhì)量濃度為10、20、40、80、160μg/mL，每個藥物質(zhì)量濃度設(shè)6個復(fù)孔，空白對照組不加藥，置于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24h及48h，每孔加入20μL MTT（5mg/mL），再置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄上清液，每孔加入100μL DMSO振蕩5min，用酶聯(lián)儀（瑞士Tecan公司、Sunrise酶標(biāo)儀）在492nm波長下測定各孔光吸收值（OD值），記錄結(jié)果。細(xì)胞抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞抑制率=（空白對照組OD均值-藥物組OD均值）/空白對照組OD均值× 100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

本次MTT實(shí)驗(yàn)顯示，蟲草素對于胰腺癌BxPc3以及淋巴轉(zhuǎn)移胰腺癌BxPc3-LN5細(xì)胞株均具有一定的細(xì)胞毒效應(yīng)。且細(xì)胞生長的抑制率都隨著藥物作用時間的延長及藥物質(zhì)量濃度的升高而增加。比較各組濃度的蟲草素對于兩株細(xì)胞在24h和48h末所產(chǎn)生的細(xì)胞抑制率，發(fā)現(xiàn)無論是BxPc3或是BxPc3-LN5，在48h末的細(xì)胞抑制率均高于其在24h末的抑制率。見圖1，2。可以認(rèn)為蟲草素對于胰腺癌BxPc3、BxPc3-LN5細(xì)胞株的細(xì)胞抑制作用呈時間依賴性。

而比較兩株細(xì)胞分別于24h與48h在不同濃度的蟲草素作用時的細(xì)胞抑制率，發(fā)現(xiàn)隨著蟲草素劑量的升高，細(xì)胞的抑制率也隨著上升，呈現(xiàn)一個明顯的劑量依賴性。見圖3～6。

比較蟲草素對于兩株細(xì)胞的作用差別可以發(fā)現(xiàn)，無論在24h末或48h末，蟲草素對于BxPc3細(xì)胞株的抑制作用均要略好于BxPc3-LN5細(xì)胞株。見圖7，8。可能是因?yàn)锽xPc3-LN5細(xì)胞株屬于高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株，其對于抗腫瘤藥物的耐藥性要高于原代細(xì)胞株。

3 討論

近年來，盡管胰腺癌分子水平研究取得了顯著進(jìn)步，但5年生存率仍沒有顯著提高，較晚出現(xiàn)的臨床癥狀、較低的手術(shù)切除率、較高的術(shù)后復(fù)發(fā)率以及對放化療不敏感是造成這一狀況的主要原因[10，11]。在胰腺癌的治療方面，除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療與化療，又出現(xiàn)了基因干擾和靶向治療，使胰腺癌的防治工作有了突破性進(jìn)展。同時應(yīng)用中藥進(jìn)行綜合調(diào)節(jié)治療胰腺癌也成為近年研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，中藥復(fù)方或單味中藥提取的有效成分在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，促進(jìn)凋亡以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、減毒增效等方面也有其獨(dú)到的優(yōu)勢。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，從中藥中提取的一些生物堿類物質(zhì)在腫瘤防治方面具有重要作用，如從紫唐松草和唐松草等的根中分離得到的唐松草堿和厚果唐松次堿對W256有顯著的抑制作用，國外已進(jìn)入臨床研究[12]。從山豆根中提取的異喹啉類生物堿（蝙蝠葛堿）和從胡椒果實(shí)中分離的主要生物堿（胡椒堿）對CNE-1、CNE-2Z鼻咽癌細(xì)胞株的生長增殖均有抑制作用，并呈時間依賴性抑制[13]。

早在20世紀(jì)70年代就已發(fā)現(xiàn)蟲草素具有抗腫瘤作用。目前現(xiàn)有的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為蟲草素抗腫瘤的機(jī)制是多方面的，主要是抑制DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成，降低c-myc基因的mRNA表達(dá)，并可增強(qiáng)放療及某些化療藥物的敏感性；并因其半衰期短，可聯(lián)合腺苷脫氨酶抑制劑或羥基脲增加療效；同時其可增強(qiáng)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷力，有免疫調(diào)節(jié)的作用。

蟲草素已被證實(shí)對艾氏腹水癌、人鼻咽癌KB細(xì)胞和人宮頸癌HeLa細(xì)胞等皆具有明顯的抑制作用[14，15]，對KB細(xì)胞的最低致毒質(zhì)量濃度為（10～25）g/mL。Nakamura等[16]報(bào)道，蟲草素通過激發(fā)腫瘤細(xì)胞中腺嘌呤核苷A3受體，可以抑制小鼠B16-BL6黑素瘤細(xì)胞和Lewis肺癌細(xì)胞的生長。但在胰腺癌方面，國內(nèi)外未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，蟲草素可以抑制胰腺癌BxPC3細(xì)胞株及其高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株BxPC3-LN5的增殖。

根據(jù)藥物量效反應(yīng)曲線（dose-response curve），大多數(shù)抗癌藥物在一定范圍內(nèi)其細(xì)胞殺傷作用有濃度依賴性，局部（準(zhǔn)確地說是細(xì)胞內(nèi)）藥物濃度增加一倍殺滅細(xì)胞數(shù)可增加10倍左右[17]。本次MTT比色法結(jié)果顯示，胰腺癌BxPc3、BxPc3-LN5細(xì)胞株對蟲草素的作用都有較強(qiáng)的敏感性，隨著蟲草素濃度的增加以及作用時間的延長，細(xì)胞增殖抑制率出現(xiàn)明顯增加。表明蟲草素及其水提物對BxPc3及BxPc3-LN5的細(xì)胞毒作用在一定范圍內(nèi)呈劑量和時間依賴關(guān)系。目前，國內(nèi)尚未見應(yīng)用蟲草素進(jìn)行胰腺癌治療的實(shí)驗(yàn)研究。我們本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，它具有明顯抑制胰腺癌細(xì)胞株增殖的作用，顯示出良好的對抗胰腺癌細(xì)胞效應(yīng)，但蟲草素產(chǎn)生的治療胰腺癌的生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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