HIV-1 gp41蛋白的表達及其免疫反應性

梁權，羅春貞，毛培菊，王縵

·生物診斷技術·

HIV-1 gp41蛋白的表達及其免疫反應性

梁權，羅春貞，毛培菊，王縵

目的高效表達 HIV-1 gp41 基因片段，滿足生產 HIV 體外檢測試劑的需要。

HIV-1； 蛋白質類； 免疫活性

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2011, 6(6):415-419

HIV 在我國的流行形勢日趨嚴峻，全國首次HIV 分子流行病學調查發現有 A、B（歐美 B）、B′（泰國 B）、C、D、E 和 F 7 種亞型，其中 B（占 47％）、C（占 34％）是主要流行亞型。第 2 次全國 HIV 流行病學調查顯示有 A、B、B′、C、D、E、F 和 G 8 種亞型及 2 個流行重組型 BC 和AE，其中 B′ 亞型（29％）、重組型 BC（50％）和重組型AE（15％）是主要流行亞型[1]。

由于 HIV 病毒的高度變異性，針對各亞型gp41 蛋白表位的特異性抗體有一定差異，使用HIV 抗體檢測試劑盒檢測患者血清中的 HIV-1 gp41 抗體會出現假陰性結果。如研究顯示，目前所用的幾種抗體檢測試劑盒檢測 A 亞型 HIV 病毒感染者血清敏感性較低。因此，加強對 HIV-1 各亞型 gp41 蛋白表位的比較研究對提高現有檢測試劑盒的免疫反應性具有重要意義。

在前期工作中，我們表達了幾種我國 HIV-1主要流行亞型的 gp41 蛋白，對這些蛋白進行免疫反應性和特異性的測定，根據測定結果對 gp41 基因表位進行篩選和整合[2-5]，優化出一條含多亞型表位的 gp41 基因片段。本實驗在前期工作的基礎上，將 gp41 基因片段的 N 端引入一段融合基因，通過大腸桿菌原核表達方式獲得溶解性較好、特異性和免疫反應性均較高的重組蛋白，為 HIV 體外血清學診斷提供原料，也為進一步研究 HIV-1 gp41蛋白表位的功能打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1質粒和菌種 含部分心肌鈣蛋白（cTnI）基因的表達質粒 E1 由本公司構建并保存；宿主細胞DH5α、BL21DE3 由本公司保存；含優化的 HIV-1 gp41 基因質粒 X1 由本公司前期構建并保存。

1.1.2主要試劑 國家藥品生物制品檢定所 HIV參考血清（批號：20081201）由本公司保存；HIV 抗體測定反應板 HIV plate 由本公司生產并保存；1000 份 HIV 確證陰性血清由本公司保存；含部分cTnI 基因（與 E1 質粒中 cTnI 基因相同）與HIV-2 gp36 基因的重組蛋白 CP1 由公司制備并保存；HIV-1 gp41 蛋白 X1 由公司制備并保存；辣根過氧化物酶（HRP）標記鼠抗人二抗 IgG-HRP由本公司制備并保存；HIV-1 陽性血清、HIV-2 gp36單抗（monoclonal antibody，McAb）CN2、HIV-1 gp41 McAb GP47 由公司制備并保存。

1.2 方法

1.2.1引物設計 根據 X1 基因序列相關資料，設計一對 PCR 引物，上游引物 P1：5′ GCGGGATC CGCAGTGGGAATAGGAGCTTTG 3′，下游引物P2：5′ GCGCTCGAGCAATAATTCTTGTTCATTCT T 3′。擴增 gp41 基因片段的上游引物引入 BamH I酶切位點，下游引物中引入 Xho I 位點。

1.2.2基因擴增及純化 以 X1 質粒為模板，加入相應的引物、DNTP、LA Tag 聚合酶進行 PCR擴增，反應條件為 94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃1 min，共 30 個循環。使用生工生物工程（上海）有限公司 UNIQ-10 柱式 PCR 產物純化試劑盒純化 PCR 產物。

1.2.3表達載體構建 純化后的各 PCR 產物經BamH I 和 Xho I 酶切后，2％ 瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，使用生工生物工程（上海）有限公司UNIQ-10 柱式 DNA 膠回收試劑盒純化回收，連入表達載體 E1，構建克隆質粒 E1-1，將其轉化入DH5α 細胞中，篩選陽性克隆，使用生工生物工程（上海）有限公司 UNIQ-10 柱式質粒小量抽提試劑盒提取陽性克隆質粒，并將其轉化至 BL21DE3中。

1.2.4重組蛋白的表達與純化 將含有重組質粒的 BL21DE3 菌株接種于含有氨芐青霉素鈉（50 μg/ml）的 8 ml LB 培養基中，37 ℃ 培養過夜；次日，按 1∶100 擴大培養至A600 = 1.0 時，加入 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，繼續培養 3 h。收獲細菌，菌體懸浮于 PBS 中（140 mmol/L NaCl，10 mmo1/L Na2HPO4·12H2O，1.8 mmol/L KH2PO4，2.7 mmol/L KCl，pH 7.5），冰浴下超聲破菌，取少量上清和沉淀進行 12％ SDS-PAGE 電泳。收取超聲后的上清，按 Qiagen 公司的 Ni-NTA Agaros 純化步驟進行表達蛋白的純化。

1.2.5重組蛋白包被活性檢測 間接 ELISA 方法檢測活性，取上述 1.2.4 步驟純化后的重組蛋白用 PBS 稀釋至終濃度為 0.5 μg/ml，包被微孔反應板，包被量為 100 μl/孔，取 CP1 和 X1 蛋白按相同條件包被作為陰性和陽性對照，包被板置 4 ℃過夜，次日加入 5％ 脫脂奶粉 200 μl/孔，置 37 ℃封閉 2 h，檢測的一抗為 HIV-1 陽性血清、CN2 McAb、TP47 McAb、HIV 陰性血清（單抗稀釋度為 l∶5000），二抗為 IgG-HRP，吸光度（A）由酶標儀在 630 nm 和 450 nm 雙波長下測定。

1.2.6重組蛋白接酶活性檢測 將重組蛋白E1-1 用 PBS 稀釋至終濃度為 5 mg/ml，標記HRP[6]，配套 HIV plate 雙抗原夾心法檢測 1000 份HIV 陰性血清和國家藥品生物制品檢定所 HIV參考血清。

1.2.7血站臨床實驗 按上述 1.2.6 步驟，生產配套 HIV ELISA 檢測試劑，以此作為考核試劑，以國外某公司生產的人類免疫缺陷病毒抗體（HIV1 + 2）及抗原（HIV1p24）聯合檢測試劑盒作為參比試劑，檢測 8085 份確證陰性血樣。

2 結果

2.1 gp41 基因 PCR 擴增及重組子鑒定

使用引物 P1、P2 進行 PCR 擴增的產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，可見擴增產物約 450 bp 的DNA 片段（圖1），大小與預期設計相同。重組質粒經 BamH I 和 Xho I 雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析顯示重組質粒被切成大小約 5900 bp 的表達載體 E1 和 450 bp 的 gp41 截短基因（圖1），與預期一致。

圖1 gp41 片段瓊脂糖凝膠電泳鑒定Figure l Identification of gp41 gene fragment by agarose gel electrophoresis

2.2 重組菌的表達鑒定及純化

E1-1 重組菌裂解產物進行 SDS-PAGE 電泳分析，顯示誘導的重組菌裂解產物在大小約 37 kD的位置出現一條高濃度的 gp4l 融合蛋白區帶（圖2），與預期大小一致，經可見光掃描分析，表達產物占菌體總蛋白量約 29.5％。

SDS-PAGE 電泳顯示大部分目的蛋白存在于裂解上清，經 Ni-NTA Agaros 純化，僅有少量蛋白質殘留在穿過液中，大部分目的蛋白被純化基質特異性吸附，經洗滌液清洗后，大部分目的蛋白由洗脫液洗出，經可見光掃描分析，目的蛋白純度約為95.1％。

2.3 重組蛋白包被活性鑒定

間接 ELISA 方法檢測各一抗標本，如表 1 所示，重組蛋白 E1-1 與 HIV-1 陽性血清反應、與TP47 McAb 反應、與 HIV 陰性血清無明顯反應，檢測結果與陽性對照板一致。

2.4 重組蛋白接 HRP 敏感性和特異性鑒定

1000 份 HIV 陰性血清檢測結果顯示有 1 份血清A值為 0.303，呈假陽性反應，其余血清均為陰性反應，特異性為 99.9％。HIV 參考血清中有HIV-1 型陽性血清 18 份（P1-P18），陰性血清20 份（N1-N20），靈敏度血清（S1-S6），如表 2 所示，檢測陽性血清A值均較高，檢測陰性血清有1 份呈假陽性（N18）。

圖2 SDS-PAGE 鑒定重組蛋白的表達及其純化Figure 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein expressed in E.coli and purified by Ni-NTA

2.5 臨床實驗

以參考試劑為標準，考核試劑的陰性符合率為100％（8080/8080），其中 5 例不一致樣本考核試劑檢測為陰性，參比試劑檢測為陽性，這 5 例樣本經確認后，均為陰性。最終考評結果，考核試劑的陰性符合率為 100％（8085/8085），參考試劑陰性符合率為 99.9％（8080/8085）。

3 討論

當前，國內 HIV 體外診斷試劑產品質量有了很大提高，但與國外同類試劑相比假陽性率高、漏檢現象較多，究其原因主要是原料蛋白的質量較差。一方面由于HIV亞型 gp41 基因間的差異，針對 gp41 蛋白的抗體具有型特異性，使用含單一亞型 gp41 表位的蛋白檢測HIV感染者血清會出現漏檢現象；另一方面，為了提升檢測試劑的免疫反應性而增加蛋白的使用量或種類，結果導致檢測的特異性下降、假陽性率增高。

表1 重組蛋白包被活性檢測Table 1 ELISA detection of antigens coated by the recombinant protein

表2 國家藥品生物制品檢定所 HIV 參考血清檢測結果Table 2 ELISA detection of national drug testing of biological products inspection institute HIV panel

根據我們對HIV體外診斷使用原料的研究發現，選擇 gp41 表位的同時，需要對表達載體進行選擇，如利用不同表達載體表達的 gp41 融合蛋白在免疫反應性和特異性上有一定的差異，因此提高原料的質量不僅要選擇好 gp41 表位，還要選擇正確的融合基因。為了提升原料蛋白的質量，我們采取的設計方案是首先將目前 HIV 主要流行亞型表位串聯在一起，其次找到一段保守基因與之融合。前期工作中，通過對目前我國 HIV 流行病學的研究，我們確認 BC 重組亞型和 AE 重組亞型為主要流行亞型，通過對兩種分離株 CRF-01、CRF-08基因的分析和比對，利用基因工程方法對其 gp41基因進行改造，選取保守性強的高表位區，對易引起非特異性的某些高表位區進行基因突變，最終優化出一條含有多亞型表位的 gp41 基因片段。在融合基因的篩選實驗中，我們選擇了 dsbA、Trx、MBP、GST、cTnI 等五個蛋白的部分基因，分別與兩種亞型的 gp41 基因融合表達，通過活性檢測比較，cTnI 作為融合肽表達的融合蛋白表位暴露充分、特異性好。

為了獲得敏感性強、特異性高的 HIV 體外診斷用原料，本實驗在前期工作基礎上，獨創性地將部分 cTnI 基因與 HIV gp41 基因融合，融合基因成功克隆入大腸桿菌并在上清中得到了高效表達，通過金屬螯合親和層析純化，重組蛋白純度達到95％ 以上，達到體外診斷試劑對原料純度的要求。重組蛋白經包被反應板，間接 ELISA 檢測顯示對HIV-1 陽性血清具有較高的免疫反應性，確證所表達重組蛋白的正確。我們將重組蛋白進行 HRP 標記，與 HIV plate 反應板配套進行了一系列實驗，結果顯示，檢測 1000 份 HIV 陰性血清標本特異性達 99.9％，檢測國家藥品生物制品檢定所 HIV參考血清樣本顯示出較好的特異性和免疫反應性，在臨床實驗中與國外同類試劑的比較也表現較優。綜上，本次實驗達到預期的目標，所獲得的重組蛋白可作為原料用于生產 HIV 體外檢測試劑。

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Expression and purification of recombinant HIV-1 gp41 pr otein and determination of its immunoreactivity

LIANG Quan, LUO Chun-zhen, MAO Pei-ju, WANG Man

ObjectiveExpressions of HIV-1 gp41 antigen for in-vitro immunoassay.MethodsHIV-1 gp41 gene was amplified by PCR by using the plasmid X1 as a template, and then inserted into the plasmid E1 to construct recombinant plasmids E1-1. The expression of the recombinant plasmid in competent E.coli cell Bl21DE3 was induced with IPTG and analyzed with SDS-PAGE. After being purified by Ni-NTA affinity chromatography, the recombinant protein was further evaluated with ELISA for their functional characteristics.ResultsThe result from SDS-PAGE showed expression of E1-1 in the competent E.coli cell. The purity of the purified recombinantprotein was over 95％, and the protein has excellent immunoreactivity and specificity with ELISA.ConclusionsRecombinant protein E1-1 can be expressed with a high immunoactivity, which can be qualified for HIV ELISA production.

HIV-1; Recombinant proteins; Immunocompetence

WANG Man, Email: wangman@skhb.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.004

200233 上?？迫A生物工程股份有限公司

王縵，Email：wangman@skhb.com

2011-10-14

方法以含 HIV-1 gp41 基因的質粒 X1 為模板，采用PCR 方法擴增出 gp41基因，克隆入 E1 載體構建重組表達質粒 E1-1，轉化 E.coli BL21DE3 感受態細胞，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導后，使用鎳螯合瓊脂糖親和層析柱（Ni-NTA Agaros）純化重組蛋白，通過 ELISA法檢測重組蛋白的免疫反應性和特異性。

結果SDS-PAGE 鑒定結果表明，重組 E1-1 蛋白獲得了正確的表達；純化的重組 E1-1 蛋白純度 ＞ 95％；ELISA 檢測結果表明，重組 E1-1 蛋白具有較優的免疫反應性和特異性。結論 成功表達出具有較高免疫反應性的重組 E1-1 蛋白，可應用于 HIV 體外檢測試劑。

Author Affiliation:Shanghai Kehua Bio-engineering Co., Ltd (KHB), Shanghai 200233, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):415-419