實時熒光定量PCR檢測WISP-1/NGX6基因體系與子宮頸癌細胞增殖轉移的關系

秦杰，陳瑾，黃守國

·生物診斷技術·

實時熒光定量PCR檢測WISP-1/NGX6基因體系與子宮頸癌細胞增殖轉移的關系

秦杰，陳瑾，黃守國

目的探討原癌基因 WISP-1 和抑癌基因 NGX6 與子宮頸癌細胞增殖轉移的關系。

宮頸腫瘤； 原癌基因； 基因表達

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2011, 6(6):410-414

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，是女性患者的主要死亡原因之一。近年來子宮頸癌的防治已取得較大的進展，子宮頸癌的發病率亦明顯下降，但年輕婦女子宮頸癌的發病率則呈明顯上升趨勢，并由此引起國內外學者的廣泛關注，而尋找子宮頸癌早期診斷的基因指標及有效治療子宮頸癌的方法，進一步明確子宮頸癌發生、發展的分子生物學以及基因表達機制也已成為當前的研究熱點。雖然目前已有常規實驗方法如免疫組化等從組織學角度對子宮頸癌在蛋白質分子水平進行了分析研究，但有關基因水平的研究報道甚少，尤其是原癌基因 WISP-1/抑癌基因 NGX6 體系在子宮頸癌組織中的表達，國內外至今尚未見報道。

鑒于此，為了研究 WISP-1/NGX6 基因體系與子宮頸癌細胞增殖轉移的關系，了解其在子宮頸癌的發生、發展過程中的表達規律，本研究利用實時熒光定量 PCR技術對子宮頸癌轉移組、未轉移組及正常子宮頸組織標本中該基因體系的表達情況進行了檢測，并對比分析了 3 組標本中該基因體系的表達量，以期為進一步有效預防和治療子宮頸癌提供有利依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 90 例標本均取自中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院婦科手術切除標本，患者年齡 25 ～ 65（47.38 ± 12.35）歲。入選標本均以病理診斷為標準，其中正常子宮頸組織標本（病理診斷為慢性宮頸炎或非癌變組織）30 例，子宮頸浸潤癌（子宮頸鱗狀細胞癌）60 例，而子宮頸浸潤癌又分為轉移組和未轉移組各 30 例。所有病例術前均未經化療、放療、生物治療等其他治療，并排除其他系統合并癥及其他系統腫瘤等疾病。標本離體后立即取材，–80 ℃ 冰箱保存。

1.1.2儀器與試劑 MJ Opticon2 熒光定量 PCR儀為美國 BIO-RAD 公司產品；Taq 酶（貨號DR001A）購自日本 TaKaRa 公司；Rever Tra Ace-α-反轉錄試劑盒（FSK-100）購自日本 Toyobo 公司；其余常規化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1引物與探針的設計與合成 參考人WISP-1、NGX6 基因 mRNA 序列（GenBank：NM-080838、NM-001042590），利用 Primer express2.0 軟件分別設計針對WISP-1、NGX6 及內參照β-肌動蛋白（β-actin）的引物（P1 ～ P6）與探針，并分別在探針的 5′ 端引入 FAM 羧基熒光素，3′ 端引入熒光淬滅基團，其序列見表 1。引物和探針均由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2人子宮頸（癌）組織總 RNA 的提取 自超低溫冰箱中取出人子宮頸（癌）組織標本，迅速用剪刀剪下約 0.25 g 樣品，置于預先加入 200 μl RNAiso? Plus 的 1.5 ml EP 管中。在 RNAiso?Plus 溶液中破碎人子宮頸（癌）組織，補充 800 μl RNAiso? Plus 后混勻。冰上靜置 5 min，再加入200 μl 氯仿，旋緊后劇烈振蕩 15 s（氯仿沸點低、易揮發，振蕩時應小心離心管蓋突然彈開）。待溶液充分乳化后，在冰上靜置 5 min。4 ℃、13800 ×g高速離心 15 min 后，將上層水相移至新管中，然后加入等體積的異丙醇，冰上放置 10 min，4 ℃、13800 ×g離心 10 min。棄上清，以 1 ml 75％ 乙醇[焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制]洗滌沉淀，反復顛倒數次，4 ℃、13800 ×g離心 5 min。棄上清，空氣干燥 RNA 10 min，加入 20 μl DEPC 水溶解，立即取 2 μl RNA 溶液進行反轉錄，剩余 18 μl RNA 溶液 –80 ℃ 凍存。

1.2.3反轉錄反應 RNA熱變性：反應體系總體積為 12 μl，其中包括 25 pmol/μl 隨機引物1 μl、DEPC 水 9 μl、RNA 2 μl；65 ℃ 水浴5 min 后迅速在冰上冷卻 2 min，離心收集反應液。配制總體積為 20 μl 的反應體系，其中包括第一步變性后的 RNA 溶液 12 μl、5 × RT Buffer 4 μl、dNTP 混合物（各 10 mmol/L）2 μl，RNase抑制劑（10 U/μl）1 μl，Rever Tra Ace 1 μl；RT反應條件為：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.2.4RT-PCR 反應 配制總體積為 25 μl 的反應體系，其中包括 10 × PCR Buffer 2.5 μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl、dH2O 16 μl、15 pmol/μl 引物 2 μl、15 pmol/μl 探針 0.3 μl、5 U/μlTaq酶0.2 μl、反轉錄反應產物 cDNA 2 μl。PCR Buffer成分：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）、500 mmol/L KCl、15 mmol/L MgCl2。加樣至 96孔定量 PCR 反應孔中，每個樣品同時設 3 孔，用于檢測同一個指標基因的樣本統一上機。在 MJ Opticon2 熒光定量PCR 儀上擴增，反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃5 s，55 ℃ 30 s，共 40 個循環，讀取 FAM 熒光數值；30 ℃ 5 s。

1.3 統計學處理

應用 SPSS 19.0 統計學軟件進行數據的統計分析。計量資料基因表達量均采取隨機獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WISP-1 基因表達量的比較

采用實時熒光定量 PCR方法分別檢測子宮頸癌組織轉移組與未轉移組、正常子宮頸組織中WISP-1 基因的表達量，結果表明原癌基因WISP-1在子宮頸癌組織未轉移組中表達量明顯高于正常子宮頸組織（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宮頸癌組織轉移組中表達量明顯高于未轉移組（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宮頸癌組織轉移組中表達量明顯高于正常子宮頸組織（F= 44.770，t= –5.638，P= 0.000、P＜ 0.001）（表 2）。

表1 實時熒光定量 PCR引物與探針序列Table 1 Sequences of primers and probes for real-time fluorescence quantitative PCR

表2 WISP-1 基因在子宮頸（癌）組織中的表達Table 2 The expression of WISP-1 gene in thecervical (cancer) tissues

2.2 NGX6 基因表達量的比較

采用實時熒光定量 PCR方法分別檢測子宮頸癌組織轉移組與未轉移組、正常子宮頸組織中NGX6 基因的表達量，結果表明抑癌基因NGX6在子宮頸癌組織未轉移組中表達量明顯低于正常子宮頸組織（P= 0.000、P＜ 0.001）；在子宮頸癌組織轉移組中表達量明顯低于未轉移組（P= 0.001、P＜ 0.05）；在子宮頸癌組織轉移組中表達量明顯低于正常子宮頸組織（F= 20.760，t= 6.024，P= 0.000、P＜ 0.001）（表 3）。

表3 NGX6 基因在子宮頸（癌）組織中的表達Table 3 The expression of NGX6 gene in the cervical (cancer) tissues

3 討論

腫瘤的惡變過程包括細胞增殖、DNA 過度復制、細胞周期功能紊亂、細胞永生化、逃逸凋亡、血管增生及轉移浸潤等一系列過程，相應的分子機制主要有原癌基因的激活、抑制癌基因失活等[1]。原癌基因是指一大類可促進細胞分裂并有潛在致癌或促癌作用的基因群；抑癌基因或抗癌基因則是一大類可抑制細胞生長并有潛在抑制癌變作用的基因群。原癌基因的激活與抑癌基因的失活，使細胞生長與分化的調節失控，導致細胞持續分裂和癌變。當抑癌基因失活后，可能使原癌基因充分發揮它的作用而導致腫瘤的發生和發展，但某一種原癌基因與抑癌基因對細胞分裂的正負調控作用，僅僅局限在某一種特定細胞的范疇內有效[2]。正是基于這一認識，目前關于腫瘤細胞增殖的研究正迅速開展，以期在基因水平揭示腫瘤增殖轉移的本質，為改進腫瘤的診斷方法和治療手段提供依據。因此，本研究選用實時熒光定量PCR技術對子宮頸癌及正常子宮頸組織標本中WISP-1/NGX6 基因體系的表達量進行了對比分析，以探討WISP-1/NGX6 基因體系對子宮頸癌細胞增殖轉移的影響。

WISP-1 基因是在對大鼠高轉移性和低轉移性黑色素細胞突變體進行 RNA 差異篩選時被發現存在于低轉移性黑色素細胞中[3]。同時研究發現，WISP-1 基因定位于人染色體 8q24.1 ～ 8q24.3[4]，其轉錄的原始 mRNA 有 5 個外顯子，經剪切加工成2 種轉錄變異體，是一種富含半胱氨酸且長度為367 個氨基酸的分泌性蛋白多肽。采用 PCR 測定人多種組織樣本中WISP-1 基因的表達，發現其存在于多種組織器官，如成人心臟、腎臟、肺、胰腺、胎盤、卵巢、小腸、脾，而在腦、肝臟、骨骼肌、結腸、外周血白細胞、前列腺、睪丸和胸腺中，WISP-1 基因低表達或不表達[5]。WISP-1 基因的生物學功能包括促進細胞增殖、介導細胞黏附、促進細胞外基質增長、刺激細胞轉移等生物學功能，同時也可調節較復雜的生物學過程，參與血管形成和腫瘤形成[6]。WISP-1 是 Wnt-1-β-連環蛋白信號通路的下游靶基因，β-連環蛋白是 Wnt 信號通路的關鍵成分，可以與 Wnt 信號通路中的其他成分相結合，它在細胞質和細胞核中的水平改變還可影響某些基因的表達；在細胞質中突變的 β-連環蛋白將與 DNA 結合因子相互作用，進而激活下游基因，引起一系列的改變，促進腫瘤形成；而WISP-1 作為該通路的下游靶基因，自然與腫瘤的形成緊密相關[7-10]。

本研究發現，子宮頸癌組織轉移組與未轉移組中WISP-1 基因的表達量均高于正常子宮頸組織，且子宮頸癌組織轉移組中該基因的表達量明顯高于未轉移組，由此說明WISP-1 基因與子宮頸癌細胞的增殖及轉移成正相關，即該基因可促進子宮頸癌的形成，對癌細胞轉移亦有促進作用，但具體作用機制還有待進一步研究。

NGX6 基因是中南大學腫瘤研究所分子遺傳室采用定位候選克隆策略克隆而成的一個鼻咽癌候選抑瘤基因（基因登陸號：AFl88239），其定位于染色體 9P21 ～ 22 區。而 9P21 ～ 22 區域的等位基因雜合性丟失現象是人類多種腫瘤組織中的共同事件，這提示NGX6 基因可能為腫瘤相關基因[11]。生物信息學分析表明該基因 cDNA 全長2.1 kb，編碼 1 個含 338 個氨基酸的跨膜蛋白，其具有 2 個跨膜結構（234 ～ 256、269 ～ 291），胞外區含有 1 個 EGF-like domain（185 ～ 221）、3 個N-糖基化位點（92 ～ 95、100 ～ 103、172 ～ 175）；胞內區較短，含有 1 個酪氨酸激酶磷酸化位點（257 ～ 268），提示 NGX6 基因可能編碼 1 種跨膜蛋白，并通過其酪氨酸激酶磷酸化位點、N-糖基化位點等功能域調控細胞的增殖、黏附和運動等生物學過程[12]。同時，有研究已經證實 NGX6 基因在結腸癌，尤其在伴有遠處轉移的結腸癌組織中表達明顯下降甚至缺失[13]。另外，有實驗已初步證實NGX6 基因可對 Wnt-1-β-連環蛋白信號通路進行負調控，并推測 β-連環蛋白可能即為 NGX6 的作用靶點[14]。

本研究發現，NGX6 基因在子宮頸癌組織轉移組及未轉移組中表達量均低于正常子宮頸組織，且子宮頸癌組織轉移組中該基因表達量明顯低于未轉移組，由此說明 NGX6 基因表達量的降低與子宮頸癌的發生相關，亦與子宮頸癌的轉移相關。

綜上，本研究結果表明，原癌基因 WISP-1 在子宮頸癌組織轉移組及未轉移組中的表達量均明顯高于正常子宮頸組織，在子宮頸癌組織轉移組中的表達量明顯高于未轉移組；抑癌基因 NGX6 在子宮頸癌組織轉移組及未轉移組中表達量均低于正常子宮頸組織，在子宮頸癌組織轉移組中的表達量明顯低于未轉移組，即提示 WISP-1/NGX6 基因體系表達異常與子宮頸癌的發生有關，并且其作用均與 Wnt 信號通路有關。但本實驗標本局限于新鮮組織，要求術后 30 min 內立即取材保存，子宮頸癌患者取材對病理報告結果具有一定不良影響，因此實驗標本數量偏少。此外，本實驗僅對 WISP-1 和 NGX6 基因的表達情況進行了檢測及詳細分析，而對于其基因功能未進行具體研究，因此關于WISP-1/NGX6 基因體系可否作為子宮頸癌早期診斷與監測的基因指標，其是否參與子宮頸癌的發生、發展等問題尚有待進一步實驗研究。

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Correlation betw een WISP-1/NGX6 gene expr ession and cervical cancer cell pr oliferation and/or metastasis analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR

QIN Jie, CHEN Jin, HUANG Shou-guo

ObjectiveTo explore the correlation between oncogene WISP-1 and tumor-suppressor gene NGX6 expression and cervical cancer cell proliferation and/or metastasis.MethodsPrimers and probes were designed and synthesizes based on the mRNA sequence of human WISP-1 and NGX6 gene, respectively. Total RNA were extracted from human normal cervixtissues (30 cases) as well as non-metastasis and metastasis group (30 cases for each group) of cervix invasive cancer (cervical squamous cell carcinoma) tissues, and the expressions of WISP-1 and NGX6 gene were detected and compared by real-time quantitative fluorescence PCR.ResultsThe expression of the oncogene WISP-1 in both metastasis and non-metastasis group of cervical cancer tissues were significantly higher than normal cervical tissues (with P ＜ 0.001 for both). Moreover, WISP-1 gene expression in the metastasis group was significantly higher when compared to the non-metastasis group of cervical cancer tissues (P ＜ 0.001). The expression of tumor-suppressor gene NGX6 in both metastasis group and non-metastasis group of cervical cancer tissues were lower than normal cervical tissues (with P ＜ 0.001 for both). Similarly, NGX6 gene expression in the metastasis group was significantly lower when compared to the non-metastasis group of cervical cancer tissues (P ＜ 0.05).ConclusionWISP-1/NGX6 gene expression has correlation with cervical cancer cells proliferation and metastasis.

Uterina cervical neoplasms; Proto-oncogenes; Gene expression

HUANG Shou-guo, Email: shouguohuang@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.003

海南省自然科學基金（2011-SZR-01-093）

570208 ?？冢心洗髮W湘雅醫學院附屬?？卺t院婦產科

黃守國，Email：shouguohuang@126.com

2011-10-14

方法參考人 WISP-1、NGX6 基因 mRNA 序列分別設計引物與探針。提取人正常子宮頸組織（30 例）、子宮頸浸潤癌（均為子宮頸鱗狀細胞癌）組織未轉移組及轉移組（各30 例）總 RNA，采用實時熒光定量 PCR 技術分別檢測各組標本組織中 WISP-1、NGX6 基因的表達量并進行對比分析。

結果原癌基因 WISP-1 在子宮頸癌組織轉移組及未轉移組中的表達量均明顯高于正常子宮頸組織（均 P ＜ 0.001），在子宮頸癌組織轉移組中的表達量明顯高于未轉移組（P ＜0.001）。抑癌基因 NGX6 在子宮頸癌組織轉移組及未轉移組中的表達量均低于正常子宮頸組織（均 P ＜ 0.001），在子宮頸癌組織轉移組中的表達量明顯低于未轉移組（P ＜0.05）。

結論WISP-1/NGX6 基因體系與子宮頸癌的細胞增殖有關，并且與子宮頸癌細胞的轉移亦有相關性。

Author Affiliation:Department of Gynecology and Obstetrics, Affiliated Haikou Hospital, Xiangya Medical College of Central South University, Haikou 570208, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):410-414