代謝組學(xué)技術(shù)在藥物安全性研究中的應(yīng)用

方 舟,方 芳,孫長海

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科,黑龍江佳木斯 154003)

經(jīng)典的對藥物等化合物的安全性評價,是通過給予一定數(shù)量的實驗動物大劑量的待測化合物,觀察其毒性效應(yīng)特征,然后將其實驗結(jié)果外推到接受小劑量相同化合物的大量人群。它是一項涉及多學(xué)科的綜合性的毒理學(xué)評價過程。然而,這些評價手段還存在著許多缺點,比如實驗動物和人對藥物反應(yīng)存在種屬差異;動物使用劑量與人體實際接觸劑量的差異;動物數(shù)量有限,難以發(fā)現(xiàn)發(fā)生率低的毒性反應(yīng)等;此外還有實驗周期長及費用昂貴等問題[1]。因此,研究篩選靈敏度高、特異性強(qiáng)和實驗周期短的藥物安全評價方法是毒理學(xué)科研工作者十分關(guān)心的重大課題。

與經(jīng)典方法相比,代謝組學(xué)能更快、更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)毒性物質(zhì)及其毒性規(guī)律,尤其對于多靶點的綜合性毒性反應(yīng),代謝組學(xué)可從多個角度進(jìn)行全面評價,故有利于藥物的研發(fā)和藥物安全性方面的研究。

代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代初興起的一門對細(xì)胞、組織或器官以及整個生物體系所有小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析的新技術(shù)。它采用核磁共振(NM R)或質(zhì)譜(MS)技術(shù)為主要檢測手段,將測量得到的生物體液、組織的代謝數(shù)據(jù)與化學(xué)計量學(xué)聯(lián)系起來,建立復(fù)雜生物體系的代謝譜圖,與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)一起揭示生命運動的本質(zhì)和規(guī)律。近年來,代謝組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)和藥理學(xué)(如藥物安全性評價、生物標(biāo)志物的鑒別及毒性的分類和篩選等)、功能基因組學(xué)(如鑒別和確證動物模型)、疾病診斷、環(huán)境毒理學(xué)等。本文僅就代謝組學(xué)在藥物安全性評價方面的應(yīng)用作初步論述。

1 代謝組學(xué)概況

1999年,Nicholson小組[2]基于對生物體和細(xì)胞內(nèi)小分子代謝產(chǎn)物的多年研究提出了“代謝組學(xué)”的概念。代謝組學(xué)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想,對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式,是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。先進(jìn)分析檢測技術(shù)結(jié)合模式識別和專家系統(tǒng)等計算分析方法是代謝組學(xué)研究的基本方法。

代謝組學(xué)的分析方法多種多樣,以核磁共振波譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為主[3]。核磁共振波譜法包括核磁共振氫譜法,核磁共振碳譜法,核磁共振磷譜法,色譜-質(zhì)譜連用法包括GC-MS和 HPLC-MS。

藥物代謝產(chǎn)物是在藥物代謝酶的作用下生成的最終產(chǎn)物,通過對機(jī)體代謝產(chǎn)物的深入研究,可以判斷機(jī)體是否處于正常狀態(tài),而對基因和蛋白質(zhì)的研究都無法得出這樣的結(jié)論。目前,已經(jīng)研究清楚的普通代謝途徑包括三羧酸循環(huán)(TCA),糖酵解,花生四烯酸(AA)/炎癥途徑。

在代謝組學(xué)的研究中,如果試驗中發(fā)現(xiàn)樣本中三羧循環(huán)底物異常時,則提示可能與機(jī)體能量代謝途徑的紊亂相關(guān),同時三羧循環(huán)氧化酶系均存在與細(xì)胞的線粒體中,因此,三羧循環(huán)的紊亂可能預(yù)示著線粒體的紊亂。在代謝組學(xué)的研究中,三羧循環(huán)的紊亂是被檢測到頻率最高的代謝通路之一。

有研究表明[4],尿液中?；撬岷康淖兓菣z測肝臟損傷的重要指標(biāo)。檸檬酸、2-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,其變化與肝臟能量代謝相關(guān),可反映肝臟線粒體的功能[4,5]。

代謝組學(xué)研究的技術(shù)平臺包括以下幾個部分:樣品的收集、生物反應(yīng)的淬滅、樣品預(yù)處理、儀器分析與鑒定、數(shù)據(jù)分析和標(biāo)志物生物學(xué)意義解讀以及機(jī)體生化反應(yīng)機(jī)制和生命現(xiàn)象的認(rèn)知。其中,代謝產(chǎn)物的檢測、分析與鑒定是代謝組學(xué)技術(shù)的核心部分,它主要利用LC-MS、GC-MS以及NM R等各種高通量、高分辨、高靈敏度的譜學(xué)技術(shù)對樣品進(jìn)行分離分析 。但由于各種技術(shù)均有其各自的優(yōu)缺點和適用范圍,且內(nèi)源性化合物具有理化性質(zhì)多樣性、濃度范圍變化大等特點,故需采用各種技術(shù)聯(lián)用和方法整合的策略,保證盡可能精確地分析生物體系中盡量多的代謝組分,使整個分析過程盡可能多地保留樣品中代謝物的整體信息。利用譜學(xué)技術(shù)分析獲得的代謝指紋圖譜,經(jīng)過現(xiàn)代化學(xué)計量學(xué)和生物統(tǒng)計學(xué)領(lǐng)域的新方法對其進(jìn)行降維和信息挖掘得到可用于代謝組學(xué)研究的格式。

2 相關(guān)研究與應(yīng)用

將代謝組學(xué)用于藥物毒性和安全性的評價已成為目前新藥開發(fā)過程中一項倍受關(guān)注的研究課題,國外不少政府部門和單位已經(jīng)組建了相關(guān)機(jī)構(gòu)和組織專門從事此項工作,如21世紀(jì)初,英國倫敦大學(xué)帝國理工學(xué)院與6家醫(yī)藥公司聯(lián)合成立了一個研究組織—Consortium for Metabonomic Toxicology(COMET),其主要研究目標(biāo)是建立可用NM R從尿液和血漿樣本中獲得代謝數(shù)據(jù),以用于候選藥物臨床前的毒性測試的一整套毒理代謝組學(xué)研究體系和通用的標(biāo)準(zhǔn)評價方法。如今,該組織已分析了多種對肝臟和腎臟具有毒性的模型毒物,測定了它們在尿液和血清(包括生物組織)中的代謝數(shù)據(jù),并已計劃據(jù)此建立一個含有大量模型毒物信息的數(shù)據(jù)庫,進(jìn)而開發(fā)能對更多模型藥物進(jìn)行分析的專家系統(tǒng),以對候選藥物的肝臟和腎臟毒性進(jìn)行毒理學(xué)篩選,從而降低新藥的創(chuàng)新成本,縮短研發(fā)周期[6]。

此外,在對已有藥物,尤其是中藥的安全性評價方面,代謝組學(xué)技術(shù)也發(fā)揮了它的作用,如美國食品和藥品管理局(FDA)啟動了開展植物藥安全性和藥物毒性評價的代謝組學(xué)研究計劃;荷蘭還專門成立了針對中藥的代謝組學(xué)研究中心,對藥物的安全性進(jìn)行評價。近年來,在劉昌孝等院士的倡導(dǎo)下[7]國內(nèi)也已開展了一些對藥物安全性評價的代謝組學(xué)的研究。

廖艷[8]等基于核磁共振氫譜法對異煙肼肝毒性的代謝組學(xué)特征進(jìn)行了研究,將大鼠連續(xù)經(jīng)口灌胃 0、50、100、200和400mg/kg異煙肼,3、7、14d收集給藥前 24h及給藥期間每天24h的尿液,測定質(zhì)子核磁共振譜,并進(jìn)行血漿生化指標(biāo)測定和肝臟組織學(xué)檢查。結(jié)果常規(guī)毒性研究方法顯示異煙肼在較高劑量、較長給藥時間(7d以上)時表現(xiàn)出肝毒性,并且有較好的時間-效應(yīng)關(guān)系。對大鼠尿液進(jìn)行代謝組學(xué)研究顯示各組動物代謝譜各不相同,隨著給藥時間的變化大鼠尿液NMR譜發(fā)生一定改變,代謝譜的改變與常規(guī)毒性檢測指標(biāo)相符且更靈敏。與正常對照組比較給藥組尿樣NM R譜葡萄糖和牛磺酸顯著增加,2-酮戊二酸和檸檬酸顯著降低。大鼠尿液NM R代謝軌跡與異煙肼毒性作用時間密切相關(guān),異煙肼引起的肝毒性與線粒體功能受損、三羧酸循環(huán)中能量代謝異常及葡萄糖代謝紊亂有關(guān)。

廖艷等[9]還按照同樣方法研究利福平肝毒性時效關(guān)系,將大鼠隨機(jī)分成兩組和1個空白組,使用兩個不同濃度給藥,結(jié)果各組大鼠尿液的代謝譜各不相同,隨著時間的推移,大鼠尿液NMR譜發(fā)生一定改變,尿樣NMR譜葡萄糖和牛磺酸顯著增加,2-酮戊二酸和檸檬酸顯著降低。同樣大鼠尿液NM R代謝軌跡與利福平作用時間密切相關(guān),利福平引起的肝毒性與三羧酸循環(huán)中能量代謝異常及葡萄糖代謝紊亂有關(guān)。

劉霞[10]等基于NM R代謝組學(xué)方法分析馬兜鈴酸I(AA-I)誘導(dǎo)的雌雄小鼠急性腎毒性,分析了小鼠尿樣的代謝特征,揭示出馬兜鈴酸I(AA-I)導(dǎo)致急性腎毒性的分子機(jī)理及其在雌性和雄性小鼠上差異的根源。研究結(jié)果表明,AA-I的急性腎毒性主要來自AA-I給藥后抑制了體內(nèi)的三羧酸(TCA)循環(huán)和能量代謝,破壞了體內(nèi)腸道菌群的生態(tài)平衡,改變了腎臟細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓,從而引起了腎小管的損傷。代謝模式分析顯示雄性小鼠對AA-I的腎毒性比雌性小鼠更敏感,可能源于雄性小鼠本身更低的能量代謝。

Chan等[11]采用高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜聯(lián)(HPLC/TOF-MS)方法研究了服用馬兜鈴酸后大鼠尿液的代謝圖譜,發(fā)現(xiàn)犬尿烯酸和馬尿酸為反映藥物毒性的生物標(biāo)志物,可用作評價馬兜鈴酸毒性的生物學(xué)指標(biāo)。

梁琦[12]等人進(jìn)行基于核磁共振氫譜法的廣防己的腎毒性代謝組學(xué)研究,他們選擇大鼠為實驗動物,收集尿液,將大鼠隨機(jī)分為兩組,1個正常對照組,1個給藥組,灌胃給藥。他們發(fā)現(xiàn)馬尿酸鹽、肌酐、TM AO在尿液中的含量有上升階段,這表現(xiàn)腎臟損傷能增加腎臟的濾過作用。他們還發(fā)現(xiàn)大鼠尿液中的牛磺酸的含量上升,檸檬酸的含量下降,2-酮戊二酸的含量下降,認(rèn)為廣防己還能引起肝毒性。他們還進(jìn)行血清生化分析和腎臟病理學(xué)觀察。

趙劍宇[13]等采用基于NM R的代謝組學(xué)方法研究了大鼠經(jīng)關(guān)木通染毒后,尿液的代謝表型改變及其與組織病理及尿液、血漿生化指標(biāo)的相關(guān)性:實驗大鼠被分別灌胃給予不同劑量的關(guān)木通,每天 1次,連續(xù)6d;最后,服用關(guān)木通各劑量組大鼠腎臟出現(xiàn)不同程度的炎癥壞死,尿樣中氧化三甲胺、枸櫞酸、?；撬?、肌酐、甜菜堿等內(nèi)源性代謝物水平均有不同程度的下降,而醋酸、丙氨酸水平則顯著上升;分析表明,空白對照組與關(guān)木通組的代謝譜有明顯差異,而造成組間差異的主要是醋酸和氧化三甲胺的變化,在不同劑量條件下,關(guān)木通各組大鼠的代謝譜也各不相同,而此與腎臟病理和血漿生化改變相一致。

李建新等[14]采用基于NM R的代謝組學(xué)方法研究了雷公藤甲素的腎臟毒性,發(fā)現(xiàn)尿樣中甜菜堿、二甲基甘氨酸為反映藥物對腎乳頭毒性的生物標(biāo)志物;內(nèi)源性化合物醋酸鹽、乳酸、甘氨酸為反映藥物對腎臟皮層S1段毒性的生物標(biāo)志物;丙酮為反映藥物對腎臟皮層S3段毒性的生物標(biāo)志物。其中以醋酸鹽、甜菜堿和丙酮含量升高最為顯著。這些代謝物的變化說明大鼠尿液代謝組學(xué)分析能夠較好地反映雷公藤甲素的腎毒性特征,并能對毒性作出早期預(yù)測。

樊夏雷等[15]人應(yīng)用GC/MS及模式識別技術(shù)為核心的代謝組學(xué)方法對大鼠尿樣及血漿樣品進(jìn)行研究,結(jié)果表明,給藥后2d和4d,血漿中代謝組水平、大鼠尿液與給藥前產(chǎn)生明顯變化,內(nèi)源性代謝產(chǎn)物譜隨時間動態(tài)變化明顯,能夠明顯區(qū)分出各天的變化趨勢,表征出毒性發(fā)生,發(fā)展的動態(tài)過程。得出結(jié)論是關(guān)木通能夠?qū)δI臟造成損害。應(yīng)用基于GC-MS的代謝組學(xué)方法,初步獲得關(guān)木通致腎臟損害的“代謝產(chǎn)物譜”,根據(jù)不同的代謝表型能夠區(qū)分出關(guān)木通的毒性作用。大鼠尿液、血漿中的代謝產(chǎn)物譜與關(guān)木通毒性作用的經(jīng)時過程密切相關(guān),能夠很好區(qū)分出機(jī)體的不同中毒狀態(tài)。

3 結(jié)語

代謝組學(xué)技術(shù)為藥物安全性研究提供了新的思路與方法,在藥物安全性研究中已取得了一定的成果,但仍有些不足,目前代謝組學(xué)在理論和技術(shù)上還有很多問題有待解決,例如分析檢測技術(shù)和數(shù)據(jù)處理技術(shù)還有待提高,得出數(shù)據(jù)的可靠性還未得到確證等,這在一定程度上限制了代謝組學(xué)在藥物安全性評價中的進(jìn)一步應(yīng)用。藥物安全性歷來是臨床應(yīng)用中倍受關(guān)注的問題,特別中藥安全性問題是中藥國際化的主要障礙之一。由于中藥種植的生態(tài)環(huán)境、炮制方法、配伍應(yīng)用、體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、生物活性和臨床應(yīng)用均存在多樣性的特點,故很難逐一搞清其中的哪一種化學(xué)成分產(chǎn)生的毒副作用,而代謝組學(xué)因其高通量及靈敏度和特異性上的優(yōu)勢將會成為闡明某些中藥毒性及安全性的有效方法和途徑之一。將能反映整體觀的代謝組學(xué)用于對中草藥毒性的研究,對于確保中藥用藥的合理性和安全性,建立現(xiàn)代中藥的藥理、毒理評價體系,指導(dǎo)臨床擬訂合理的臨床用藥方案、劑量和時間均有理論意義和實用價值[7],且對我國當(dāng)前的中藥安全性研究起到推動作用。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,各種組學(xué)數(shù)據(jù)的成功對接,代謝組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)的方法必將對藥物的安全性方面的研究產(chǎn)生推動作用。

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