微生物維生素E產(chǎn)業(yè)化開發(fā)進展

張姍姍

(青島科技大學化工學院，山東青島 266042)

微生物維生素E產(chǎn)業(yè)化開發(fā)進展

張姍姍

(青島科技大學化工學院，山東青島 266042)

維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，僅在光合細菌和高等植物中合成，具有重要的生理學功能。纖細裸藻能有效積聚α－生育酚。本文綜述了通過代謝和基因工程、培養(yǎng)系統(tǒng)和反應器等方面的研究來有效生產(chǎn)生育酚的進展情況，旨在促使工業(yè)化生產(chǎn)維生素E成為可能。

維生素E;纖細裸藻;培養(yǎng)系統(tǒng);光生物反應器

Abstract:Vitamin E are fat－ soluble antioxidants that is synthesized by photosynthetic and higher plant，have most significant physiological roles.Euglena gracilis is promising for commercial production of α －tocopherols，this prograph have investigated metabolic and genetic engineering、cultivation systems and photobioreactors for efficient production of tocopherol，make it possible for large － scale commercial production.

Key words:vitamin E;euglena gracilis;cultivation systems;photobioreactors

1 簡介

維生素E(VE)是光合作用細胞合成的脂溶性抗氧化劑。維生素E臨床上可用于治療老年性癡呆癥、高血壓、冠心病、心肌梗塞、動脈硬化、血栓和不孕癥等［1］。作為抗氧化劑和自由基捕獲劑，維生素E還可以保護類囊體成分免受氧化破壞，在電子轉(zhuǎn)移反應、細胞膜滲透性和流動性方面有重要作用，因此它可以用作膜穩(wěn)定劑。

VE的生理學活性高，天然VE作為營養(yǎng)補充劑和抗氧化劑廣泛應用于醫(yī)藥、保健品、食品、營養(yǎng)品和化妝品中，但價格昂貴主要供人類使用?；瘜W合成的價格低廉，但中間產(chǎn)物對人體健康有潛在威脅，只用于飼料加工。VE是生育酚類化合物的總稱。根據(jù)類異戊二烯基側(cè)鏈飽和度的不同分為生育酚和生育三烯酚，根據(jù)芳環(huán)上甲基位置和數(shù)目的不同又各有α、β、δ及γ 4種類型。其中α－生育酚生物學活性最高［2］。所有的同系物存在于植物和光合作用的微生物中，它們的濃度和比例取決于植物種類、組織、微生物和培養(yǎng)條件。由于α－生育酚是最有效的亞型，因此選擇有利于它合成的菌株和培養(yǎng)條件來發(fā)酵生產(chǎn)。

2 天然生育酚的來源

2.1 高等植物作為生育酚的來源

生育酚普遍存在于植物組織，尤其是雙子葉植物的葉和種子、豆油、麥麩和小麥胚芽中。傳統(tǒng)上，用有機溶劑如己烷來提取植物組織中的生育酚;現(xiàn)在考慮使用超臨界流體如超臨界CO2來提取［3］。植物油富含生育酚，但是高等植物作為其來源存在一個問題，就是生育酚含量很低。

2.2 微生物作為生育酚的來源

微生物希望有高生育酚濃度、高比例α－生育酚、高細胞生長率、高細胞濃度、簡單的培養(yǎng)條件、便宜的培養(yǎng)媒介、低污染敏感性等特點。能積累生育酚的微藻有螺旋藻、杜氏藻、集胞藻、綠藻等［4］。菌種中研究最廣泛的是裸藻，其生育酚濃度為每克細胞中1.12～7.35mg。研究發(fā)現(xiàn)纖細裸藻有最高的生育酚生產(chǎn)力［5］;并且能獲得高密度細胞，是少數(shù)幾個能同時生產(chǎn)β胡蘿卜素、維生素C和維生素E的微生物之一［6］，其合成的生育酚超過97%是α型，沒有細胞壁，可以很容易地提取生育酚。與其他微生物相比，裸藻有很好的開發(fā)潛力和發(fā)展前景，所以主要討論這種光合細菌。

為了大量合成而對植物和微生物進行了基因工程和代謝工程。分析生育酚合成的原理和反應，已經(jīng)克隆了5個酶的基因并做了功能鑒定，這些基因?qū)⒗谖覀冊诜肿雍蜕缴涎芯亢筒僮鱒E合成。依據(jù)表達的酶在合成中的作用將這些基因分成兩類:一類主要提高VE總量，另一類主要影響VE成分。正常培養(yǎng)條件下，微生物積累的超過90%是α－生育酚，因此，微生物的基因工程應旨在增加VE總量。

VE的芳香性前體是尿黑酸和對羥基苯丙酮酸，合成對羥基苯丙酮酸是植物積聚VE的限制性步驟。通過表達煙草植物里的預苯酸脫氫酶基因和過表達擬南芥的對羥基苯丙酮酸二加氧酶HPPD序列，在預苯酸水平上合成VE，這能高度積累生育酚［7］。玉米種子中HGGT的過表達使生育酚和生育三烯酚增加了6倍［8］，并采用分子標記輔助作用。多種途徑旨在增加植物中VE總量。

高等植物基因或代謝工程的研究很多，而微生物的研究很少。集胞藻屬中的藍藻菌株P(guān)CC 6803具有進行基因工程良好的特點。誘導表達HPPD基因時，總VE增加了5倍。但是沒有高生育酚生產(chǎn)者的基因修改報告。

葉綠體缺陷纖細裸藻W14ZUL菌株中增加有機碳源能增加線粒體的活性、活性氧濃度和α－生育酚的生產(chǎn)力。野生型裸藻Z的異養(yǎng)培養(yǎng)中，活性氧的產(chǎn)生與α－生育酚的生產(chǎn)力之間正相關(guān)。因此，其最優(yōu)化培養(yǎng)條件必須控制這些因素;而且，適合細胞生長的條件不一定適合積聚生育酚。

光似乎是影響生育酚生產(chǎn)的最重要因素，光強度和生育酚積聚存在正相關(guān)性。連續(xù)光照比光暗循環(huán)積聚的生育酚多，葉綠體和線粒體都參與了生育酚的合成，Kusmic等人說缺少葉綠體的裸藻中光都能促進生育酚合成。細胞器的相對貢獻依賴于培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基的組成也會影響生育酚合成。

3 培養(yǎng)系統(tǒng)

3.1 光合自養(yǎng)培養(yǎng)

光合自養(yǎng)是培養(yǎng)光合作用微生物最普遍的方法。光合自養(yǎng)污染危險小時，α－生育酚的積聚量很高;但在生長晚期細胞開始死亡和溶解，異養(yǎng)生物引起污染。光合自養(yǎng)培養(yǎng)時，限制細胞生長和α－生育酚積聚的主要問題是光照的供給(數(shù)量、質(zhì)量和分布)。太陽光作為唯一光源時，細胞量和生育酚積聚主要取決于天氣條件。光照時間依賴于位置和時期，它可能很短，故大部分時期培養(yǎng)受光照限制，生育酚積聚很低。現(xiàn)已發(fā)明整合太陽光和人造光來持續(xù)照明。當太陽光強度降到設(shè)定值時，系統(tǒng)自動從太陽光轉(zhuǎn)為人造光。純光合自養(yǎng)適用于小規(guī)模α－生育酚生產(chǎn)，它操作簡單，投資和運營成本低，但其生產(chǎn)力和生物量很低，不適合商業(yè)在生產(chǎn)。

3.2 異養(yǎng)培養(yǎng)

裸藻和其他微生物(如綠藻、衣藻等)在缺少光照條件下能利用有機碳進行異養(yǎng)生長，雖然異養(yǎng)生長的裸藻生育酚含量比光合自養(yǎng)低，但異養(yǎng)生物反應器也可以生產(chǎn)生育酚。通過優(yōu)化有機碳源和通氣量條件，可以得到高濃度細胞和生育酚含量。由于光能成本高和反應器內(nèi)部光分散的技術(shù)問題，異養(yǎng)培養(yǎng)商業(yè)化生產(chǎn)生育酚可能性很高［9］。

3.3 光能異養(yǎng)培養(yǎng)

光合自養(yǎng)培養(yǎng)時細胞濃度低、生育酚濃度高，異養(yǎng)培養(yǎng)則相反，光異養(yǎng)培養(yǎng)能同時獲得高濃度的細胞和生育酚。光異養(yǎng)培養(yǎng)中，光合自養(yǎng)和異養(yǎng)的代謝活動之間存在相互作用。葡萄糖作為裸藻的有機碳時，低光強度下光合自養(yǎng)和異養(yǎng)代謝活動同時獨立進行，因此光異養(yǎng)培養(yǎng)的生長速率和最終細胞濃度值是兩者的加和。然而，高光照強度抑制了光合作用和葡萄糖的吸收，導致細胞濃度降低，但生育酚濃度卻很高。說明異養(yǎng)代謝對光抑制作用的敏感性高于光合自養(yǎng)。裸藻進行光異養(yǎng)培養(yǎng)時，適合細胞生長的條件與利于α－生育酚積聚的條件不同。細胞的生長受有機碳吸收的控制，而α－生育酚積聚則受光合自養(yǎng)代謝的控制。為得到高濃度的細胞和α－生育酚，應調(diào)節(jié)兩種代謝活動的比例。光合自養(yǎng)對細胞生長的貢獻會隨著光強度、通氣中CO2濃度的增加和有機碳源供料速度的降低而增加。限制有機碳使代謝平衡轉(zhuǎn)移到光合自養(yǎng)上。若有機碳過量，就算在高光強度下α－生育酚量也很低。微生物培養(yǎng)可以利用許多有機碳，如乙醇、乳酸和半乳糖等可以有效地積聚α－生育酚，葡萄糖和果糖則有利于細胞的生長，且混合基質(zhì)比單個有效［10］。

裸藻光異養(yǎng)培養(yǎng)積聚α－生育酚的潛能很高?？梢垣@得相當高的生產(chǎn)力，且光合作用產(chǎn)生的氧被有機碳吸收，同時碳同化釋放的二氧化碳被光合作用利用。

3.4 相繼的異養(yǎng)—光合自養(yǎng)培養(yǎng)

在光能異養(yǎng)培養(yǎng)中，適合有機碳吸收的條件與生育酚積聚的條件不同。為了得到最高容量的生育酚生產(chǎn)率，優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)時必須在兩者之間做出妥協(xié)。從光合自養(yǎng)活動中分離有機碳，吸收作用可以避免這一問題，分別優(yōu)化它們。在異樣培養(yǎng)條件下，纖細裸藻Z生產(chǎn)的細胞量比光能自養(yǎng)條件多，但維生素卻相對較少。為增加VE量，應用兩步培養(yǎng)，即先將細胞在異養(yǎng)條件下培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到自養(yǎng)下繼續(xù)培養(yǎng)。實驗結(jié)果表明，在高細胞密度下利用兩步培養(yǎng)，纖細裸藻的VE生產(chǎn)能力有了明顯提高。異養(yǎng)末期獲得的細胞濃度取決于光合自養(yǎng)階段光的提供。在有機碳類型、濃度、通氣量、培養(yǎng)基成分和流體力學壓力方面來優(yōu)化異養(yǎng)階段;另一方面，在初始細胞濃度、光強度和分布、CO2供給、培養(yǎng)基組成等方面優(yōu)化光合自養(yǎng)。傳統(tǒng)的異養(yǎng)生物反應器，在異養(yǎng)階段能夠保持單一培養(yǎng)，開放池塘中進行的光合自養(yǎng)，污染也不是個嚴重問題;因為它細胞濃度高、培養(yǎng)期限短且缺少有機碳。

3.5 循環(huán)的光合自養(yǎng)—異養(yǎng)培養(yǎng)

光生物反應器照明的能耗很高，且太陽光不穩(wěn)定，每天只有不到6h的有效光適合光合作用細胞生長。黑暗條件下，細胞不能生長，還消耗有機碳，使細胞濃度降低。循環(huán)性光合自養(yǎng)—異養(yǎng)培養(yǎng)能解決這個問題，它使有機碳量在晚上增加，可以獲得光、暗循環(huán)下連續(xù)生長的細胞［11］。為了獲得最大生產(chǎn)率，須選擇合適的有機碳源，且添加恰好的量使沒有剩余的有機碳轉(zhuǎn)入到光周期里。當葡萄糖作為有機碳時，在異養(yǎng)階段的夜里，α－生育酚的濃度會降低，但會在光合自養(yǎng)階段恢復。但用乙醇時，α－生育酚的濃度在這兩個階段會保持穩(wěn)定。光合自養(yǎng)階段若只利用太陽光，光強度波動會影響α－生育酚的量。使用太陽光、人造光和有機碳供給的整合系統(tǒng)［12］，光源在光亮時為太陽光，陰天時自動會轉(zhuǎn)為人造光。確保了光合自養(yǎng)階段穩(wěn)定的光供給，相同培養(yǎng)條件下α－生育酚的量是純光合自養(yǎng)的5倍。

4 光生物反應器

光生物反應器包括開放培養(yǎng)系統(tǒng)(如自然水域、人工池塘等)和封閉光生物反應器(如管狀光生物反應器、平板光生物反應器等)。傳統(tǒng)海洋微藻多采用開放式培養(yǎng)系統(tǒng)，存在培養(yǎng)條件難以控制、生產(chǎn)周期受季節(jié)限制、易受污染等不可克服的缺點［13］。管狀光生物反應器轉(zhuǎn)移量低，異養(yǎng)代謝很難維持無菌條件，故也不適合。

光生物反應器應當設(shè)計成平板或垂直塔形狀的。相對長的光途徑(＞50cm)或者局部陰影能使細胞生長和α－生育酚積聚之間保持良好平衡。平板式光生物反應器具有高液體循環(huán)速度和較小的光衰減度，更利于藻體細胞對光的吸收，操作簡單、容易放大，適合于微藻的規(guī)?；呙芏扰囵B(yǎng)。

5 未來展望

VE具有顯著的生理活性，是人類生命活動中不可缺少的物質(zhì)。近年來，微藻合成VE已成為研究的熱點。微藻工業(yè)化生產(chǎn)VE要考慮很多因素，有經(jīng)濟成本、污染問題、培養(yǎng)系統(tǒng)、培養(yǎng)裝置、光源和有機碳源等。目前還不能用裸藻大規(guī)模生產(chǎn)生育酚，今后研究分析生物學、基因工程、光生物反應器和微生物培養(yǎng)中的成熟技術(shù)和設(shè)備，利于調(diào)控和優(yōu)化培養(yǎng)，易于規(guī)模放大，勢必會加快微藻及其產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化進程。

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Progress of Industrialization Development of Microorganism Vitamin E

ZHANG Shan－Shan
(College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266042，China)

TQ466.5

A

1003－3467(2011)03－0032－03

2010－10－26

張姍姍(1987－)，女，碩士研究生，從事藥物與生物工程研究，電話:13791913034。