氧化苦參堿膠束納米粒制備及其體外抗腫瘤活性研究＊

金 楠，趙永星，孫 倩，劉 敏，鄧書華

（鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001）

氧化苦參堿（oxymatrine）是一種從類狐尾草的槐屬草本的種子或淺黃色槐的根中提取的雙稠哌啶類生物堿[1]，主要用于肝炎治療[2]，最近研究顯示其還具有抗腫瘤作用[1]。然而氧化苦參堿的強(qiáng)親水性使其胃腸道的滲透性及吸收度較差[3－4]，不利于口服給藥，且臨床應(yīng)用的氧化苦參堿注射液半衰期短、療效低[5]。傳統(tǒng)劑型的氧化苦參堿血液濃度低、分布狹窄、在肝腫瘤中蓄積少[6]，而粒徑多在50～300 nm間的新型納米制劑[7]可經(jīng)控制粒徑來增加藥物在肝臟的分布。氧化苦參堿的O/W分配系數(shù)為0.2，不易制成脂質(zhì)體[8]，采用常規(guī)的脂質(zhì)體制備方法，包封率小于20％。聚合物膠束[9－10]具有載藥范圍廣、穩(wěn)定、安全、緩控釋等特點，多應(yīng)用于脂溶性藥物。筆者制備了尚未見報道的親水性氧化苦參堿膠束納米粒，旨在使其成為具有緩釋作用和肝靶向性的注射用新劑型。

1 儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀（美國Agilent）；Nano－ZS90型激光納米粒分析儀（英國Malvern）；全波長酶標(biāo)儀（美國Dynes）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon）。氧化苦參堿原料藥（杭州中香化學(xué)有限公司，批號為20050414）；精制卵磷脂E80、大豆卵磷脂S75、氫化磷脂 Spc－3（德國 Lipoid GmbH，批號分別為 1032370/906，776132－15/908，256261－1）；泊洛沙姆188（德國Basf）；磺酰羅丹明B（美國Sigma）；SMMC－7721細(xì)胞（河南省醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究所惠贈）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備方法選擇

分別采用兩種方法制備氧化苦參堿膠束納米粒。將不同比例的氧化苦參堿、磷脂溶于無水乙醇后，滴于泊洛沙姆188溶液中，磁力攪拌，水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無水乙醇揮發(fā)完全，過0.22μm的微孔濾膜，即得具有淡藍(lán)色乳光的氧化苦參堿膠束納米粒溶液（自組裝溶劑蒸發(fā)法）。再將不同比例的氧化苦參堿、磷脂溶于無水乙醇，水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無水乙醇揮發(fā)完全后，倒入泊洛沙姆188溶液中進(jìn)行探頭超聲，過0.22μm的微孔濾膜，即得具有淡藍(lán)色乳光的氧化苦參堿膠束納米粒溶液（探頭超聲法）。在處方相同的條件下，即氧化苦參堿∶磷脂E 80∶泊洛沙姆188∶乙醇∶水=3 g∶6 g∶3 g∶2 L∶10 L，以包封率、粒徑、聚合物分散系數(shù)（PDI）和Zeta電位為指標(biāo)對上述兩種方法進(jìn)行篩選，結(jié)果見表1。

表1 兩種制備方法比較試驗結(jié)果

可見，溶劑蒸發(fā)法所得氧化苦參堿膠束納米粒的粒徑和PDI均小于探頭超聲法，且有統(tǒng)計學(xué)差異，故本試驗選用溶劑蒸發(fā)法。2.2 處方優(yōu)化

考察材料比例對膠束納米粒影響，結(jié)合體外釋放特征，優(yōu)化制劑處方。各指標(biāo)隨材料比例的變化趨勢見表2。可見在一定范圍內(nèi)，當(dāng)其余材料比例不變時，氧化苦參堿膠束納米粒的包封率和粒徑隨氧化苦參堿用量增加呈現(xiàn)先降后升趨勢，PDI呈現(xiàn)先升后降趨勢，Zeta電位絕對值呈現(xiàn)上升趨勢；包封率、粒徑和PDI隨磷脂E80用量增呈現(xiàn)上升趨勢，Zeta電位絕對值呈現(xiàn)下降趨勢；包封率和PDI隨泊洛沙姆188用量增加呈現(xiàn)輕微上升趨勢，粒徑呈現(xiàn)先降后升趨勢，Zeta電位絕對值則呈現(xiàn)上升趨勢。

表2 氧化苦參堿膠束納米粒單因素試驗結(jié)果（1）

綜合各項指標(biāo)，可知在上述處方中N12較理想，選其進(jìn)行氧化苦參堿膠束納米粒體外釋藥特性的預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)其1h體外累積釋藥量達(dá)到93.6％。故添加氫化磷脂Spc－3進(jìn)行考察，各指標(biāo)隨材料比例的變化趨勢見表3。可見在一定范圍內(nèi)，當(dāng)其余材料比例不變時，氧化苦參堿膠束納米粒的包封率、粒徑和PDI隨氫化磷脂Spc－3用量增加呈現(xiàn)上升趨勢，Zeta電位絕對值呈現(xiàn)下降趨勢；包封率、粒徑和PDI隨無水乙醇用量增加呈現(xiàn)先升后降趨勢，Zeta電位絕對值呈現(xiàn)下降趨勢；包封率、粒徑、PDI和Zeta電位絕對值隨水用量增加均呈現(xiàn)先升后降趨勢。綜合考慮，在上述處方中LP22與LP6較理想。

表3 氧化苦參堿膠束納米粒單因素試驗結(jié)果（2）

2.3 制劑學(xué)特征考察

2.3.1 粒徑、PDI和Zeta電位考察

取少量氧化苦參堿膠束納米粒LP22，用激光納米粒分析儀測定其粒徑、PDI和Zeta電位。結(jié)果LP22粒徑在（196.7±2.0）nm左右，且近似正態(tài)分布。該膠束納米粒無色透明，帶有淡藍(lán)色乳光。

2.3.2 氧化苦參堿含量測定方法建立

采用高效液相色譜法測定氧化苦參堿含量。色譜柱為Agilent XDB－C18柱（150mm×4.6 mm，5μm）加預(yù)柱，流動相為pH=7.0的0.01mol/L乙酸銨－乙腈（92.5∶7.5），檢測波長為220 nm[6，11]，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫30℃。吸取氧化苦參堿原料藥甲醇溶液、氧化苦參堿膠束納米粒和空白膠束納米粒各20μL，添加等量甲醇至膠束納米粒澄清，混勻，取20μL進(jìn)樣。結(jié)果表明，空白膠束納米粒在上述色譜條件下對氧化苦參堿含量檢測無影響。配置質(zhì)量濃度為2.5，5.0，12.5，25.0，50.0，75.0，100.0μg/mL的氧化苦參堿甲醇標(biāo)準(zhǔn)液，各取20μL在上述色譜條件下進(jìn)樣3次，記錄峰面積。以平均峰面積（A）對氧化苦參堿質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=11.422C－0.519，r=0.999 9（n=7）。結(jié)果表明，氧化苦參堿質(zhì)量濃度在2.5～100.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，最低定量限為2.5μg/mL。方法精密度和回收率均符合要求。

2.3.3 包封率測定[12]

吸取氧化苦參堿膠束納米粒200μL，置超濾離心管中，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10min，得澄清濾液，取濾液20μL，精密添加一定量甲醇稀釋，混勻，取20μL進(jìn)行測定，計算游離氧化苦參堿的量（W游離）。另取氧化苦參堿膠束納米粒20μL，精密添加一定量甲醇稀釋，混勻，同法測定，計算其中氧化苦參堿的總量（W總）。按公式計算包封率：包封率=（W總－W游離）/W總×100％。

2.3.4 體外釋藥特性研究[6，13－15]

分別精密吸取1mL氧化苦參堿膠束納米粒和相同總藥質(zhì)量濃度的水溶液，加入透析袋中，放入盛有50mL磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）的燒杯，37℃水浴并以100 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行磁力攪拌，于不同時間點取透析液0.4mL，同時補(bǔ)充等量同溫的磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）。將不同時間點所取透析液按2.3.2項下色譜條件測定氧化苦參堿含量，按2.3.3項下方法計算氧化苦參堿膠束納米粒中氧化苦參堿的總量。計算各時間點氧化苦參堿膠束納米粒和氧化苦參堿水溶液的累積釋藥量。釋放度=釋放介質(zhì)中藥物的量/膠束納米粒中的藥物總量×100％。結(jié)果游離藥物在4h后體外累積釋藥量達(dá)到了97.54％，氧化苦參堿膠束納米粒LP22釋藥較慢，4h釋放了87.60％，具有一定的緩釋效應(yīng)（圖1）。LP6與LP22無顯著性差異（P＞0.05），但考慮到LP22包封率較大，故選其作進(jìn)一步考察。

圖1 平均累積釋藥量曲線圖

表4 LP22各項指標(biāo)隨儲存時間的變化

2.4 氧化苦參堿膠束納米粒LP22穩(wěn)定性研究

將LP22置4℃冰箱內(nèi)保存并考察氧化苦參堿膠束納米粒的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。可見4℃條件下，LP22的粒徑、PDI和Zeta電位在9 d內(nèi)均隨時間延長而略增大，而包封率的快速降低表明該膠束納米粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，應(yīng)冷凍干燥以提高其儲存穩(wěn)定性。

2.5 體外抗腫瘤活性研究

采用磺酰羅丹明B法考察氧化苦參堿膠束納米粒LP22和游離氧化苦參堿對肝癌細(xì)胞SMMC－7721的細(xì)胞毒性。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入以無血清培養(yǎng)基倍比稀釋的LP22和氧化苦參堿溶液各200μL，每個濃度設(shè)3個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，撤去含藥培養(yǎng)基，換含10％胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72h后，吸去培養(yǎng)液，加三氯乙酸（4℃預(yù)冷）固定，靜置10min，放置1h，用超純水洗遍，晾干，磺酰羅丹明B染色，冰乙酸洗5次，室溫下空氣干燥，Tris堿溶解15 min，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度值，記錄結(jié)果并計算細(xì)胞抑制率，酶標(biāo)儀檢測器的設(shè)定波長為515 nm。抑制率隨氧化苦參堿質(zhì)量濃度變化的情況見圖2。抑制率=（1－實驗組 A值/對照組 A值）×100％。可見，LP22與游離氧化苦參堿在低質(zhì)量濃度時相比顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

圖2 SMMC－7721細(xì)胞抑制率隨氧化苦參堿質(zhì)量濃度的變化

3 討論

本試驗中采用便宜易得、生物相容性好的材料制備了鮮見報道的包載親水性藥物的膠束納米粒，制備方法簡單省時，為親水性生物大分子劑型的選擇提供了新思路。一般情況下[18]，兩親性材料在極性溶劑（如水）中應(yīng)形成內(nèi)核疏水的膠束，但本膠束納米粒可以包載親水性氧化苦參堿，具有反膠束的部分性質(zhì)，究其原因，可能是泊洛沙姆188的增溶能力較弱，其以聚氧丙烯鏈段作為疏水基團(tuán)成為內(nèi)核，大量醚氧原子在內(nèi)核形成相當(dāng)親水的環(huán)境[16]。

篩選出的處方LP22，包封率大于60％，平均粒徑在200 nm以內(nèi)，且粒徑較集中。該粒徑范圍內(nèi)的制劑進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，并不直接釋放入全身循環(huán)，而是被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，使得大部分藥物在肝臟內(nèi)蓄積而實現(xiàn)肝靶向性[17]，相比游離藥物具有部分緩釋作用。LP22體外釋放4h以后速率緩慢，釋放度基本穩(wěn)定，與游離氧化苦參堿的釋放相比，二者24h后累積釋藥均大于94％，這表明透析膜對游離藥物無截留。

處方比例和工藝條件的變化對該膠束納米粒的包封率、粒徑、PDI和Zeta電位、釋放速率都有不同程度的影響：在一定范圍內(nèi)增加氫化磷脂的量可以增加包封率并有利于緩釋，但同時粒徑和PDI也隨之大幅增加，且可增大過膜時的壓力，不利于操作。這是因為飽和磷脂的相變溫度較高，其形成的膠束排列緊密且剛性較強(qiáng)[18]，故由氫化磷脂制成的膠束納米粒對小分子藥物進(jìn)行包封后，藥物不容易滲漏出來，減緩了突釋作用。LP22雖在篩選范圍內(nèi)為最優(yōu)，但仍存在突釋現(xiàn)象且穩(wěn)定性有待加強(qiáng)。由表4可知，藥物總量隨時間增加而減少，推斷膠束納米粒結(jié)構(gòu)分解后使整體體積增加，造成相同體積內(nèi)的藥物濃度減少。原因可能是磷脂相變溫度低于釋放試驗中37℃的條件[19]，其在該環(huán)境下不穩(wěn)定，造成膠束納米粒結(jié)構(gòu)分解，引起突釋。

氧化苦參堿膠束納米粒抑制腫瘤細(xì)胞增殖的研究表明，LP22在高質(zhì)量濃度時的抗腫瘤活性與氧化苦參堿溶液相比無顯著性差異，原因可能是游離藥物依賴于濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，而膠束納米粒在低質(zhì)量濃度時通過主動攝取進(jìn)入細(xì)胞，相比游離藥物進(jìn)入細(xì)胞的要多；在高質(zhì)量濃度時，氧化苦參堿溶液在細(xì)胞內(nèi)外形成了較高的濃度梯度，促使進(jìn)入細(xì)胞的藥物量增加，故顯示出與氧化苦參堿膠束納米粒相似的抗腫瘤活性。

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