小兒麻藤定喘方有效成分群的水提醇沉工藝研究＊

黃榮增，陶 群，汪 琦，馮漢鴿，余尚工，方念伯

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 630065；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 630065)

小兒麻藤定喘方是由麻黃、地龍、鉤藤等中藥組成的復(fù)方，臨床用于治療小兒哮喘多年，療效確切，方中君藥麻黃所含麻黃堿已被證明是麻黃平喘方的主要有效成分[1－3]。因此，以鹽酸麻黃堿含量為指標(biāo)，采用正交試驗法對水提醇沉的影響因素進行考察，優(yōu)選小兒麻藤定喘方有效成分群的水提醇沉工藝條件，并通過藥效試驗對優(yōu)選的工藝進行驗證，為研究該制劑平喘作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、材料與動物

Dionex－P 680型高效液相色譜儀 (美國戴安公司)；超聲波霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠)；AT－201型電子分析天平(瑞士，d= 0.01mg)。藥材麻黃、地龍、鉤藤均購自咸寧康進中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室鑒定為合格藥材；鹽酸麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為714－8501)；氨茶堿(山西云鵬制藥有限公司，批號為081001)；氯化乙酰膽堿(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為090803)；磷酸組胺(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司，批號為090812)；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸等均為分析純，水為重蒸餾水(自制)。健康清潔級幼年白色豚鼠，體重150～200g，雌雄兼用，均由湖北生物制品研究所提供，動物許可證號為SCXK(鄂)2008－0003。

2 方法與結(jié)果

2.1 吸水率測定

按處方量1/10比例取方中6味藥材，混合，加8倍量水浸泡，每隔30min觀察1次浸泡透心情況，直至藥材全部浸透，濾出未被吸收的水液，按公式計算吸水率為140%～151%，即約1.5倍。吸水率=(藥渣濕重－藥材干重)/藥材干重×100%。

2.2 鹽酸麻黃堿的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[4－6]

色譜柱：Aglient TC－C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈－0.1%磷酸水溶液(2∶98)；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：210 nm。取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL進樣，記錄色譜圖。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計算不低于3 000，鹽酸麻黃堿峰與其他雜質(zhì)峰分離度均大于1.5，峰形對稱，陰性無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.2 溶液配制

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥36 h的鹽酸麻黃堿對照品適量，加甲醇制成53μg/mg的溶液，即得對照品溶液。精密吸取水提濃縮液或醇沉液5 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，加磷酸1滴，振搖均勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例和工藝制備不含麻黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取53μg/mL的對照品溶液6，8，10，12，14μL，分別進樣2次，計算峰面積積分均值，以鹽酸麻黃堿峰面積積分均值(Y)對進樣量(X)進行線性回歸，得回歸方程 Y= 1.273 8X+0.053 9，r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿進樣量在0.32～0.74μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，連續(xù)進樣5次，測定鹽酸麻黃堿峰面積。結(jié)果的 RSD=0.24%。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，按上述色譜條件測定5次，每次間隔4 h，測定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.31%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：精密吸取同一樣品5mL，按供試品溶液制備方法制備，分別按上述色譜條件測定。結(jié)果的 RSD為0.67%(n=5)。

加樣回收試驗：精密吸取6份已知含量(1.012g/L)的同一樣品2mL，置100mL容量瓶中，分別精密加入2.16，2.31，3.18，3.15，4.07，4.14 mg的鹽酸麻黃堿對照品，按供試品溶液制備方法制備溶液，分別按上述色譜條件測定。結(jié)果方法回收率為97.5%，RSD為1.6%(n=6)。

2.2.4 樣品含量測定

精密吸取水提濃縮液或醇沉液各5 mL，分別按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定，外標(biāo)法計算樣品中鹽酸麻黃堿的含量，即得。

2.3 水提工藝條件優(yōu)選

2.3.1 正交試驗[7－9]

影響水提工藝的因素主要是加水量(因素A)、浸泡時間(因素B)、提取時間(因素C)、提取次數(shù)(因素D)，故以此作為正交試驗的考察因素，各取3個水平，以麻黃堿含量為評價指標(biāo)，選用L9(34)正交表安排試驗方案，因素水平見表1。根據(jù)處方比例稱取藥材，按設(shè)定方案進行煎煮(第1次加水時，全部按藥材吸水率1.5倍補足吸水量)，過濾，合并濾液，濃縮定容至一定體積。水提工藝正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果見表2和表3。

表1 水提工藝正交試驗因素水平表

表2 水提工藝正交試驗表與結(jié)果

2.3.2 優(yōu)選結(jié)果

以鹽酸麻黃堿含量為評價指標(biāo)，影響提取效果的因素大小順序為D＞C＞A＞B，故選擇D3C2A2B1，即第1次補足吸水量后加10倍量水浸泡2 h，其余每次加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

2.3.3 驗證試驗

按以上優(yōu)化工藝條件驗證3批樣品，測得鹽酸麻黃堿含量分別為1.154 2，1.109 4，1.136 5g/L，平均1.133 4g/L。結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本一致，說明提取工藝條件穩(wěn)定、可行。

表3 水提工藝優(yōu)選鹽酸麻黃堿含量方差分析表

2.4 醇沉工藝條件優(yōu)選[7－10]

2.4.1 正交試驗

醇沉工藝的主要影響因素有醇沉濃度(因素A)、藥液濃縮比例(因素B)和靜置時間(因素C)，故以此作為正交試驗的考察因素，各取3個水平，以鹽酸麻黃堿含量作為評價指標(biāo)，選用L9(34)正交表安排試驗方案，因素水平見表4。根據(jù)處方比例稱取藥材，按優(yōu)選的最佳水提工藝提取，將提取液混勻后均分為12份，其中9份分別按表4設(shè)計的水平進行醇沉試驗，剩余3份留作驗證試驗。濾取醇上清液，沉淀再以等體積同濃度乙醇洗滌，充分?jǐn)嚢瑁o置24 h過濾，濾液與醇沉液合并，減壓并濃縮至清膏狀，回收乙醇，定容至一定體積。醇沉工藝正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果見表5和表6。

表4 醇沉工藝正交試驗因素水平表

表5 醇沉正交試驗設(shè)計表與結(jié)果

表6 醇沉工藝麻黃堿含量方差分析表

2.4.2 優(yōu)選結(jié)果

通過方差分析，可見影響麻黃堿含量的因素大小順序為B＞A＞C，即藥液濃縮比例、醇沉濃度、靜置時間。從工業(yè)生產(chǎn)的角度，選擇A2B3C2較合適，即醇沉濃度為60%，濃縮比例為1∶1.5，靜置時間為24 h。

2.4.3 驗證試驗

將預(yù)留的3份提取液按優(yōu)選工藝條件和上述試驗方法分別處理，測得鹽酸麻黃堿含量分別為3.426，3.159，3.102g/L，平均3.229g/L。結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本一致，說明醇沉工藝條件基本穩(wěn)定。

2.5 平喘作用比較

2.5.1 方法[11－14]

取150～200g豚鼠，將4g/L磷酸組胺與20g/L氯化乙酰膽堿按1∶1混合，超聲霧化器噴霧12 s致喘，挑選120 s內(nèi)出現(xiàn)跌倒的豚鼠為合格的敏感動物。將合格豚鼠分為生理鹽水對照組、氨茶堿陽性對照組、小兒麻藤定喘湯(生藥含量為3g/mL)組、水提醇沉提取物組。陽性對照組以氨茶堿0.12g/kg灌胃，生理鹽水對照組給予等體積生理鹽水，水提醇沉提取物和小兒麻藤定喘湯按組每千克體重30g生藥給藥，連續(xù)3 d。于末次給藥后1 h，按預(yù)選方法引喘，記錄各組動物的引喘潛伏期。

2.5.2 結(jié)果

由表7可見，與生理鹽水對照組相比，水提醇沉提取物可明顯延長哮喘發(fā)作潛伏期；與小兒麻藤定喘湯組比較，其效果也顯著增強，對乙酰膽堿組胺引起的豚鼠哮喘有極顯著的抑制作用。

表7 對豚鼠乙酰膽堿組胺引喘的平喘作用比較(n=8，X±s)

3 討論

方中麻黃為君藥，故以鹽酸麻黃堿含量為指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定其含量，運用正交試驗法對水提及醇沉的工藝條件進行優(yōu)化。試驗過程中還以浸膏得率為指標(biāo)進行研究，分析得出的結(jié)果基本一致，相關(guān)數(shù)據(jù)未納入文中。值得一提的是，本試驗中最后采用整體動物行平喘試驗，比較按優(yōu)選工藝提取的成分與小兒麻藤定喘湯的平喘作用，效果良好。

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