超臨界二氧化碳法制備紫杉醇脂質體

李 爽，王海君

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

筆者采用超臨界二氧化碳沉析技術，將紫杉醇制備成脂質體，篩選出高包封率的紫杉醇的脂質體的最佳條件，這對紫杉醇的功效研究有著非常重要的意義。現報道如下。

1 儀器與試藥

高壓釜(南通市華安超臨界萃取有限公司)；壓力傳感器(北京華美恒強科技有限公司)；柱塞計量泵(上海申貝泵業有限公司)；控溫儀(余姚市工業儀表二廠)；RE－52AA型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SK2200 HP型超聲清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。紫杉醇原料藥(江蘇紅豆杉藥業有限公司康希分公司，含量99%以上，批號為H20067345)；紫杉醇對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量99.15%，批號為1534－200202)；CO2(純度為99.5%)；大豆卵磷脂(三泰精細化工有限責任公司)；膽固醇、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(廣州化學試劑廠，均為分析純)；SephadexG－50葡聚糖凝膠柱(瑞典Pharmacia公司生產，上海化學試劑廠進口分裝)。

2 方法與結果

2.1 脂質體制備

將大豆卵磷脂、膽固醇溶解于乙醇中，配得卵磷脂乙醇溶液，將紫杉醇原料藥溶液按一定的比例溶于該卵磷脂乙醇溶液中，打開超臨界二氧化碳高壓釜，將混合液加入其中。密閉高壓釜，經二氧化碳高壓泵打入CO2，調整適宜的溫度和壓力，在指定的超臨界溫度、壓強和時間下進行孵化制備脂質體，孵化結束后泄壓釋放CO2，旋轉蒸發除去乙醇后，得到脂質體混懸液，置冰箱中4℃保存。

2.2 包封率測定

取紫杉醇脂質體1 mL，上樣于SephadexG－50葡聚糖凝膠柱分離，先用30mL磷酸鹽緩沖液作為洗脫液進行洗脫，收集15mL洗脫液，測定其中紫杉醇的含量，即為包封的藥量。再用生理鹽水10mL洗脫剩余的游離藥物。另取紫杉醇脂質體1 mL，測定其中紫杉醇的含量，即為包封和未包封的藥物總量。包封率按公式計算：包封率(%)=脂質體中包封的藥物量/總藥物量×100%。

2.3 脂質體包封率影響因素考察

2.3.1 壓強

選取5個不同的壓強條件，包括30，25，20，15，10MPa，分別制備脂質體，制備條件為溫度45℃，時間30min，膜材配比(卵磷脂∶膽固醇)3∶1，原藥與膜材的質量比1∶20，乙醇的質量分數20%。按2.2項下方法測定脂質體的包封率，結果見圖1 A。可見，在較低壓強下，磷脂、膽固醇在超臨界CO2中的溶解度小，不易形成均一的脂質體膜，包封率很低；當壓強增加到20 MPa以上時，超臨界CO2對磷脂、膽固醇的溶解度顯著增大，改善了膽固醇分子在磷脂上的定向排布，包埋藥物的有效空間較大，紫杉醇更易以分子狀態存在于載體中，使得紫杉醇脂質體的包封率、載藥量均隨著壓強升高而增大；當壓強大于20MPa后，包封率雖增加，但增加非常緩慢，且壓強過大，對儀器要求也高。因此，選擇壓強為20MPa。

2.3.2 溫度

選取9個不同的溫度條件，包括20，25，30，35，40，45，50，55，60℃，分別制備脂質體，制備條件為壓強20 MPa，時間30min，膜材配比(卵磷脂∶膽固醇)3∶1，原藥與膜材的質量比1∶20，乙醇的質量分數20%。按2.2項下方法測定脂質體的包封率，結果見圖1B。可見，溫度較低時，磷脂雙分子層排列緊密，紫杉醇不易包封于脂質體中，包封效果較差；當溫度達到45℃時包封率最高，但隨著溫度繼續升高，超臨界CO2的密度減小，脂質膜的溶解度降低，不溶的磷脂在脂質體混懸液中析出，反而使包封率下降。因此，選擇溫度為45℃。

2.3.3 乙醇質量分數

選取5種不同的乙醇質量分數，包括10%，15%，20%，25%，30%，分別制備脂質體，制備條件為壓強20 MPa，溫度45℃，時間30min，膜材配比(卵磷脂∶膽固醇)3∶1，原藥與膜材的質量比1∶20。按2.2項下方法測定脂質體的包封率，結果見圖1 C。可見，在沒有乙醇存在時，脂質體膜材在超臨界CO2溶解度很小，形成的脂質體包封率、載藥量較小；加入乙醇后，增大了磷脂與超臨界CO2的分子間相互作用力，磷脂雙分子層的溶解度顯著增大，藥物包封率隨乙醇質量分數的增大而增大；但當乙醇質量分數高于20%時，過多的乙醇會破壞脂質體的穩定結構，造成脂質體膜流動性和通透性增加，使制備的脂質體包封率下降。因此，選擇乙醇質量分數為20%。

2.3.4 超臨界乳化處理時間

選取5個不同的乳化處理時間，分別為15，20，25，30，35min，分別制備脂質體，制備條件為壓強20 MPa，溫度45℃，膜材配比(卵磷脂∶膽固醇)3∶1，原藥與膜材的質量比1∶20，乙醇的質量分數20%。按2.2項下方法測定脂質體的包封率，結果見圖1 D。可見，超臨界乳化處理時間的變化對脂質體包封率影響比較小。因此，選取30min為超臨界處理時間。

2.3.5 膜材配比

選取不同的卵磷脂膽固醇比，包括1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，分別制備脂質體，制備條件為壓強20MPa，溫度45℃，時間30min，原藥與膜材的質量比1∶20，乙醇的質量分數20%。按2.2項下方法測定脂質體的包封率，結果見圖1 E。可見，隨著卵磷脂的增加，脂質體的包封率呈先升高后降低的趨勢，在卵磷脂∶膽固醇為3∶1時達到最高，這可能是由于原藥包埋達一定比例時，膽固醇的量相對減少，包埋發生滲漏，使脂質體的穩定性減小，從而使包封率降低。因此，選擇膜材配比為3∶1。

圖1 脂質體包封率影響因素考察結果

2.3.6 原藥與膜材的質量比

選取不同的原藥與膜材比，包括1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，分別制備脂質體，制備條件為壓強20MPa，溫度45℃，時間30min，膜材配比(卵磷脂∶膽固醇)3∶1；乙醇的質量分數20%。按2.2項下方法測定脂質體的包封率，結果見圖1 F。綜合考慮，選擇原藥與膜材比為1∶20。

3 討論

紫杉醇是紅豆杉屬植物中一種復雜的次生代謝產物，也是目前所了解的唯一可以促進微管聚合和穩定已聚合微管的藥物[1]，主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。但因其水溶性很差，早先多以聚氧乙基代蓖麻油與無水乙醇的混合溶液作為溶劑來溶解，這樣臨床用藥前就必須預先給予患者大劑量的地塞米松和H2受體拮抗劑，以減輕由混合溶劑引發的過敏反應和胃腸道反應，給患者帶來不必要的痛苦，同時也給臨床用藥帶來不便[2]。

脂質體通常采用的制備方法有薄膜分散法、薄膜－超聲波分散法、熔融法、凍融法、注入法、逆相蒸發法、復乳法等[3]，但這些方法都必須在制備過程中使用大量對人體有害的有機溶劑。超臨界CO2是一種無毒、惰性、不燃、價廉易得而又對環境友好的反應介質，且CO2能夠循環使用，可減少污染、節約資源，綠色環保。目前，采用超臨界CO2代替一般有機溶劑的方法在很多領域得到廣泛的應用。近10年來，基于超臨界流體的沉析技術已應用于微膠囊、微球等靶向藥物制備領域[4－5]。借鑒微膠囊的制備方法，利用超臨界CO2特殊的溶融、膨脹、沉析的性質，將紫杉醇與脂質體膜材等按一定比例混合，在一定條件下通入超臨界流體，使流體滲透并溶脹磷脂雙分子層，然后快速釋放壓力，使脂質體沉析，從而為脂質體的制備提供了一條新的途徑。

筆者通過試驗確定了采用超臨界二氧化碳法制備紫杉醇脂質體的最佳反應條件，即超臨界壓強20MPa，溫度45℃，時間30min，膜材配比(卵磷脂∶膽固醇)為3∶1，原藥與膜材的質量比為1∶20，乙醇的質量分數為20%。在此條件下制得的脂質體的包封率為76.18%，因此該方法是一種制備脂質體的較好方法。

[1]Wani MC，Taylor HL，Wall ME，et al.Plant antitumor agents VI.The isolation and structure of taxol，a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia[J].J Am Chem Soc，1971，93(9)：2 325－2 327.

[2]Zhang X，Li Y，Chen X，et al.Synthesis and characterization of the paclitaxel/MPEG－PLA block copolymer conjugate[J].Biomaterials，2005，26(14)：2 121－2 128.

[3]王瑞蓮，劉成梅，劉 偉.脂質體制備方法的研究進展[J].農產品加工(學刊)，2007(8)：12－14.

[4]Reverchon E，Adamia R.Nanomaterials and supercritical fluids[J].Jounrnal of Supercritical Fluids，2006，37(1)：1－22.

[5]李志義，趙順軒，蔣靜智.超臨界輔助霧化法制備紅霉素超細微粒[J].高校化學工程學報，2007，21(1)：43－47.