蒼耳甾醇類物質對小菜蛾的產卵及趨向行為選擇的影響

周 瓊，蘇 旭，熊正燕，顏亨梅

(1.湖南師范大學生命科學學院，長沙 410081;2.中南林業科技大學林學院，長沙 410004)

昆蟲的取食和產卵行為受多種因素影響，植物表面的化學因素 (包括揮發性和非揮發性的)和物理因素 (如顏色、表面形態結構等)直接影響昆蟲對取食和產卵場所的選擇及其產卵量 (欽俊德和王琛柱，2001;Jeffree，1986)。植物次生物質影響昆蟲行為，并作為植物防御的重要物質是目前研究的熱點之一 (Du and Yan，1994)。次生物質能夠引起昆蟲的負趨向和無定向移動，從而可避免或抑制昆蟲取食和產卵 (Barbier，1976;Lungren，1975)。研究對昆蟲取食和產卵有抑制效果的植物次生化學物質，并研制成昆蟲行為調控劑，對環境安全，且作用方式多樣，害蟲不易產生抗性，是新一代害蟲控制策略的發展方向 (孔垂華，2002;Pickett，1997)。

蒼耳Xanthium sibiricum Patrin.屬菊科蒼耳屬，是我國常見雜草，可作為中藥材和土農藥使用(侯海宮，2002;中國土農藥編輯委員會，1959)。已有的研究顯示，蒼耳提取物及其不同分離物對多種害蟲有較好的拒食、產卵忌避 (或忌避)和生長發育抑制效果 (周瓊等，2005，2006，2007)，并已分離出倍半萜內酯類物質為是耳對昆蟲的主要活性成分之一 (周瓊等，2009;Kawazu et al.，1979)。在前期研究的基礎上 (熊正燕等，2010)，我們對蒼耳氯仿萃取物進行了進一步分離提純，并測試了這些分離的結晶組分對小菜蛾的產卵和趨向行為選擇的影響，為研究蒼耳對小菜蛾的產卵忌避作用機制以及研制昆蟲行為調控劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

小菜蛾Xanthium sibiricum:由湖南省農業科學院植保所提供，在養蟲室內用自行種植、未施任何農藥的小白菜續代飼養，室溫25℃，RH60%～70%。

蒼耳:采自湖南省湘潭市郊。將新鮮蒼耳葉及果實適當陰干后，50℃恒溫烘干至脆，用植物試樣粉碎機 (天津泰斯特儀器有限公司)粉碎，過40目篩。粉末放置于4℃冰箱中保存。

印楝素 (Azadirachtion)(含量≥90%):由湖南省化工研究院國家農藥創制工程技術研究中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒼耳活性組分的分離提純

蒼耳粉末用甲醇索氏提取后，氯仿萃取 (熊正燕等，2010)。取氯仿萃取物按一定比例的石油醚、氯仿、乙醚和丙酮梯度洗脫層析柱，經TLC板分析，將等分收集到的洗脫液中比移值Rf相同的餾分進行合并后旋轉濃縮、生測，將活性高的組分進一步硅膠柱層析，如此進行多次，將分離提純的餾分用甲醇和丙酮反復重結晶，將結晶稱重后編號，4℃冰箱中保存待測。

1.2.2 對小菜蛾產卵量的影響

采用改進的葉碟法 (周瓊等，2009)。蒼耳各分離結晶組分和印楝素分別用丙酮溶解，用超純水稀釋至測試濃度 (0.1 mg/mL)，設相應濃度的丙酮水溶液為對照。接入新近羽化的小菜蛾成蟲3～5對，實驗設3次重復。分別于處理后24 h、48 h和72 h時觀察統計每片葉碟上的落卵量。

1.2.3 對小菜蛾成蟲趨向行為選擇的影響

Y型管測試參照張志春等的方法 (2006)改進，測試在晚上18∶00～24∶00進行實驗，保持室內溫度25℃。將待測樣品 (包括5個結晶組分和印楝素)用丙酮溶解為濃度0.02 mg/mL，滴加到大小為1 cm×2 cm的濾紙上，每張濾紙片滴加50 μL的樣品，以等量的丙酮濾紙片作為對照，將處理和對照濾紙各放入Y型管兩選擇臂端部的膨部，在兩臂的正上前方放置一15 W的白熾燈，作為微弱光源以吸引小菜蛾進入到Y型管臂內。測試時每次同時放入6頭小菜蛾成蟲，每處理重復6次。分別測試雄蛾、雌蛾的趨向選擇。數據用T檢驗進行顯著性差異分析。

1.2.4 蒼耳樣品的GC－MS分析條件

GC色譜條件:柱子:HP－5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm;進樣口溫度:250℃，分流比:50∶1;載氣:氦氣，流速:1.0 mL/min;采用程序升溫，起溫:80℃，升溫速率:30℃/min，終溫:280℃;160℃ 保留 3 min，汽化溫度:250℃;離子源溫度:230℃;四極桿溫度:150℃。

MS分析條件:離子源:EI;電離電壓70 eV，質量掃描范圍40～800，電子倍增管電壓1.2 kV。

1.3 數據統計處理

選擇性產卵忌避率(%)=(對照組落卵量－處理組落卵量)/(對照組落卵量+處理組落卵量)×100。產卵忌避率數值越高，表示測試物質對試蟲的忌避活性越強 (周瓊等，2007)。

選擇系數=選擇處理臂的蟲數/選擇對照臂的蟲數。當選擇系數=1，表示測試物質對試蟲無影響;選擇系數＜1，表示試蟲對測試物質有負趨向作用;選擇系數＞1，表示試蟲對測試物質有正趨向作用 (周瓊，2004)。

利用SPSS軟件的成對數據T檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

在活性追蹤的基礎上，蒼耳氯仿萃取物經多次硅膠柱層析及重結晶，獲得多個無色透明的結晶組分，取其中5個結晶組分 (分別編號為:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)用于小菜蛾成蟲的產卵和行為選擇測試。

2.1 蒼耳不同結晶組分對小菜蛾的產卵的影響

蒼耳結晶組分對小菜蛾落卵量的影響見表1，可以看出，在處理后24 h、48 h、72 h，結晶組分Ⅳ、結晶組分V和印楝素處理組的落卵量明顯少于相應的對照組，兩者之間差異達顯著水平 (P＜0.05)甚至極顯著水平 (P＜0.01)。其中，組分V對小菜蛾有明顯的產卵忌避效果，處理后24 h、48 h和72 h的選擇性產卵忌避率分別高達75.76%、85.45%、65.85%，甚至高于印楝素的活性 (后者分別為 61.29%、42.86% 和36.26%)，其次為組分Ⅳ (選擇性產卵忌避率分別為42.10%、39.33%和47.65%)，組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ產卵忌避活性不強或無產卵忌避活性。

表1 蒼耳不同結晶組分對小菜蛾產卵忌避作用Table 1 Oviposition deterrent effect of components from X.sibiricum on P.xylostella in leaf disc choice bioassays

2.2 蒼耳不同結晶組分對小菜蛾成蟲趨向行為選擇的影響

行為選擇測試中，在所設定的時間仍停留在Y型管的處理臂和對照臂的記為有效，未選擇者不計。結果見表2，可以看出，無論雌、雄性別，小菜蛾成蟲進入結晶組分V和印楝素處理臂的蟲數明顯低于對照臂的蟲數，處理臂與對照臂間的蟲量差異均達到極顯著水平 (P＜0.01);在結晶組分Ⅳ的測試中，小菜蛾在處理臂的蟲量也少于對照臂，但顯著性分析發現兩者之間差異不顯著 (P＞0.05);組分Ⅲ處理中，雌蟲在處理臂和對照臂的蟲量相同，但雄蟲在處理臂的蟲量少于對照臂，且兩者之間差異顯著 (P＜0.05)，說明組分Ⅲ對雌蟲和雄蟲的影響不同，對雌蟲的選擇無影響，但對雄蟲的選擇有影響，可減少雄蟲的選擇。

表2 小菜蛾成蟲對蒼耳不同結晶組分的選擇Table 2 Choices of P.xylostella adults to diffrent fractions from X.sibiricum in Y-tube

圖1 蒼耳不同結晶分對小菜蛾成蟲選擇行為的影響Fig.1 Effect of different fractionts from X.sibiricum on chcices behavir of P.xylostella adults

小菜蛾成蟲對蒼耳不同結晶組分及印楝素的選擇系數見圖1，圖中顯示，小菜蛾成蟲選擇組分V和印楝素的系數最低 (雌雄分別為0.29、0.35和0.31、0.21)，負趨性最強;組分Ⅳ次之，選擇系數分別為0.89和0.81;雌性小菜蛾成蟲對組分Ⅲ的選擇系數為1，表明小菜蛾雌蟲對組分Ⅲ無趨性反應。值得一提的是，雄蟲對組分Ⅲ的選擇系數僅為0.53，說明其對雄蟲有忌避效果。但經方差分析發現，蒼耳的各結晶組分測試中，小菜蛾雌蟲和雄蟲的選擇系數之間差異均不顯著 (P＞0.05)，提示蒼耳這些活性物質對小菜蛾成蟲的作用效果，與小菜蛾的性別無明顯相關。

2.3 蒼耳結晶組分的GC-MS分析

對小菜蛾成蟲產卵忌避和負趨向活性高的蒼耳結晶組分Ⅳ和V進行GC－MS分析，結果發現兩種結晶含有相似的化學成分，均以豆甾醇(Stigmasterol)和谷甾醇 (Gamma sitosterol)為主，另有極少量的菜油甾醇 (Campesterol)，但結晶組分V的豆甾醇含量 (51.8%)略高于谷甾醇(45.4%)，而結晶組分Ⅳ的豆甾醇含量 (40.0%)略低于谷甾醇 (56.7%)。

3 結論與討論

植物甾醇是植物體中的一類天然活性甾類物質，廣泛存在于各種植物油、堅果和植物種子中(盛漪等，2002)，小鼠的毒理實驗表明植物甾醇屬于實際無毒物 (張莉華，2010)，具有抗癌(Awad and Fink，2000)、調節免疫 (Bouic and Lamprecht，1999)等方面的功效。植物甾醇在植物抵抗許多不利因素 (生物的和非生物的)的過程中發揮重要作用 (張喜春等，2001)。關于植物甾醇對昆蟲的作用報道的較少 (岑伊靜等，2004;劉志茹等，2000;張國洲等，2000)。閆鳳鳴(2003)認為植物產生蛻皮激素或結構相近的植物蛻皮甾類物質 (phytoecdysteroid)的生理功能可能與防御昆蟲的取食有關。本研究結果說明蒼耳甾醇類物質對小菜蛾成蟲的產卵和行為選擇有明顯影響;同時，蒼耳結晶組分V與Ⅳ的化學組成相似，均含谷甾醇、豆甾醇和少量的菜油甾醇，但對小菜蛾的活性卻有一定差異，組分V的活性明顯高于Ⅳ，提示植物甾醇不同成分或相同成分的不同比例組成對昆蟲行為的影響有差異。

本研究使用Y管測試蒼耳甾醇對小菜蛾的行為選擇的影響，以弱光源作為引誘小菜蛾成蟲的刺激源，成蟲受光吸引隨機進入兩臂內，但到達處理臂膨部接觸甾醇物質后選擇回避離開，而進入對照臂中的試蟲由于未接觸甾醇物質受光吸引而選擇留下，從而造成處理臂與對照臂之間蟲量的差異，前者明顯低于后者，測試結果與選擇性產卵忌避實驗的結果一致，即在產卵忌避實驗中，產卵忌避率高的成分，在Y－型管測試中小菜蛾的選擇系數也低，由于植物甾醇的分子量較大 (張喜春，2001)，提示近距離的嗅覺和接觸化學感受器在小菜蛾的產卵行為中可能起重要作用，該結果與Justus and Mitchell(1996)一致。

魏輝等 (2002)研究顯示小菜蛾的產卵忌避行為受觸角、跗節和產卵器上的化學感覺器影響。通過分子生物學技術，張志春等 (2009)發現小菜蛾的化學感受蛋白 (CSP)不僅存在于小菜蛾的觸角中，還存在于頭、足、腹和翅中。本研究結果，蒼耳甾醇物質對小菜蛾雌性和雄性成蟲的行為選擇影響差異不顯著，提示小菜蛾對該類物質的化學感受器不存在或不僅僅存在于產卵器上。那么，蒼耳甾醇類活性物質究竟是通過作用于小菜蛾哪些部位的化學感受器而引起小菜蛾的行為抑制，小菜蛾的化學感受機制如何?它們是如何協調控制，使小菜蛾表現產卵忌避行為的，尚待深入的研究。

References)

Awad AB，Fink CS，2000.Phytosterols as anticancer dietary components:evidence and mechanism of action.Journal of Nutrition，130(9):2127－2130.

Barbier，1976.Introduction to Chemical Ecology.Ferenczi M，ed，1979.London:Longman Press.

Bouic PJ，Lamprecht JH，1999.Plant sterols and sterolins:a review of their immune －modulating properties.Alternative Medicine Review，4(3):170－177.

Cen YJ，Pang XF，Ling B，Kong CH，2004.Study on the active components of oviposition repellency of Mikania micrantha H.B.K.against citrus red mite，Panonychus citri McGregor.Acta Ecologica Sinica，24(11):2542－2547.［岑伊靜，龐雄飛，凌 冰，孔垂華.2004.薇苷菊提取物對桔全爪螨的產卵驅避作用及有效組分分析.生態學報，24(11):2542－2547］

China Traditionary Insecticides Editor Committee，1959.China Traditionery Insecticides.Peijing:China Sci.Press.165.［中國土農藥編輯委員會.1959.中國土農藥志.北京:科學出版社.165］

Du YJ，Yan FS，1994.The role of plant volatiles in tritrophic interactions among phytophagous insects，their host plants and natural enemies.Acta Entomologica Sinica，37(2):233－250.

Hou HG，Lu YT，Su YH，Xu PY，Zhang CX，Zeng JX，2002.Textual studies on Xanthium sibirium in ancient Chinese medicinal literatures.Chinese Traditional and Herbal Drugs，33(12):1128－1130.［侯海宮，呂益濤，蘇耀海，徐培元，張彩霞，曾菊霞，2002.蒼耳本草考證和藥用文獻考實.中草藥，33(12):1128 －1130］

Jeffree CE，1986.The cuticle，epicuticular wax and trichomes of plants，with reference to their structure，functions and evolution.In:Insects and the Plant Surface.Juniper B，Southwood SR，eds.London:Edward Arnold Ltd，23－61.

Justus KA，Mitchell BK，1996.Oviposition site selection by the Diamondback Moth，Plutella xylostella(L.)(Lepidoptera:Plutellidae).Journal of Insect Behavior，9(6):887 －898.

Kawazu K，Nakajima S，Ariwa M，1979.Xanthumin and 8－epi－xanthantin as insect development inhibitors from Xanthium canadense Mill.Cell Molecular Life Science，35(10):1294 －1295.

Kong CH，2002.Frontier fields of plant chemical ecology in the 21st century.Chinese Journal of Applied Ecology，13(3) ∶349－353.［孔垂華，2002.二十一世紀的植物化學生態學前沿.應用生態學報，13(3)∶349－353］

Liu ZR，Hu YC，Ren FL，Zhang J，Mo JC，Wang WX，2000.Extraction，separation and bio－assay of Daphne genkwa active components.Journal of Central South Forestry University，20(4):15－19.［劉志茹，胡云楚，任風蓮，張軍，莫建初，王問學，2000.芫花殺蟲活性組份的浸提、分離與生物測定.中南林學院學報，20(4):15－19］

Lungren L，1975.Natural plant chemicals acting as oviposition deterrents on cabbage butterflies［Pieris brassicae，P.rapae，P.napi］ .Zoological Science，4:253－258.

Pickett JA，Wadhams LJ，Woodcock CM，1997.Developing sustainable pest control from chemical ecology.Agriculture Ecosystems＆Enwronment Agriculture，Ecosystems and Environment，64:149 －156.

Qin JD，Wang CZ，2001.The relation of interaction between insects and plants to evolution.Acta Entomologica Sinica，44(3):360－365.［欽俊德，王琛柱，2001.論昆蟲與植物的相互作用和進化的關系.昆蟲學報，44(3):360－365］

Sheng Y，Hua W，Gu WY，2002.The distribution of phytosterol in food scources.Foods and Oils，(5):40－41.［盛漪，華偉，谷文英，2002.植物甾醇資源在食品原料中的分布.糧食與油脂，(5):40 －41］

Wei H，Hou YM，Yang G，You MS，2002.A primarily study on the sensilla mechanism concerning the oviposition deterrent of Plutella xylostella.Wuyi Science Journal，18(12):55－59.［魏 輝，侯有明，楊廣，尤民生，2002.小菜蛾產卵忌避行為的化學感覺器機理的初步研究.武夷科學，18(12):55－59］

Xiong ZY，Zhou Q，Su X，2010.The antifeedant effect and enzyme activity of extract from Xanthium sibiricum on Pseudaletia Separate.Journal of Natural Science of Hunan Normal University，33(1):120－123.［熊正燕，周瓊，蘇旭，2010.蒼耳氯仿萃取物對粘蟲的拒食作用及酶活性的影響.湖南師范大學自然科學學報，33(1):120－123］

Yan FM，2003.Chemical Ecology.Beijing:Science Press.54.［閆鳳鳴，2003.化學生態學.北京:科學技術出版社.54］

Zhang GZ，Wang WY，Xu HH，Wu GQ，Zhao SH，2000.Isolation and identification of extraction of Stellera chamaejasme(Ⅱ).Journal of Anhui Agricultural University，27(4):345－347.［張國洲，王亞維，徐漢虹，吳恭謙，趙善歡，2000.瑞香狼毒殺蟲活性成分的提取與分離 (Ⅱ).安徽農業大學學報，27(4):345－347］

Zhang LH，Xu XD，Shao B，Ye SM，Hong YM，2010.Toxicological safety assessment of phytosterol.China Oils and Fats，35(5):19－22.［張莉華，許新德，邵斌，葉雙明，洪毅敏，2010.植物甾醇毒理學安全性評價.中國油脂，35(5):19－22］

Zhang XC，Han ZH，ХоджайоваЛТ ЛутоваЛА，2001.Sterols biosynthesis and their physiological role in plants.Plant Physiology Communications，37(5):452－457.［張喜 春，韓振海，ХоджайоваЛТ ЛутоваЛА，2001. 植物體內甾醇的合成和生理作用.植物生理學通訊，37(5):452－457］

Zhang ZC，Wang MQ，Wang N，Li J，Zhang GA，2006.Olfactory responses of Plutella xylostellato polyamines.Acta Entomologica Sinica，49(1):142－145.［張志春，王滿囤，王楠，李娟，張國安，2006.小菜蛾對多胺的嗅覺反應.昆蟲學報，49(1):142 －145］

Zhang ZC，Wang MQ，Zhang GA，2009.Molecular cloning and expression characterization of a chemosensory protein gene PxylCSPl from the diamondback moth，Plutella xytostella(Lepidoptera:Plutelidae).Acta Entomological Sinica，52(2):140－146.［張志春，王滿國，張國安.2009.小菜蛾化學感受蛋白基因的克隆和表達.昆蟲學報，52(2):140－146］

Zhou Q，Liang GW，Kong CH，Huang SS，2004.Repellent effect of volatile oil from whitefly(Syngonium podophyllum)on aphids and its chemical constituents.Chinese Journal of Applied Ecology，15(5):856－858.［周瓊，梁廣文，孔垂華，黃壽山，2004.白蝴蝶揮發油對蚜蟲的驅避作用及其化學成分.應用生態學報，15(5):856 －858］

Zhou Q，Liang GW，Zeng L，2005.Interferential effect of some plant extracts and pesticides on the growth and development of Myzus persicae and Lipaphis erysimi(Kaltenbach).China Vegetables，128(2):15－17.［周瓊，梁廣文，曾玲，2005.幾種植物提取物和藥劑對桃蚜和蘿卜蚜生長發育的影響.中國蔬菜，128(2):15 －17］

Zhou Q，Liu BR，Shu YH，He Y，2006.Antifeedant and oviposition deterrent effect of extracts from Xanthium sibiricum and other medicinal plants against Plutella xylostella L.(Lepidoptera:Plutellidae)China Vegetables，(2):17－20.［周瓊，劉炳榮，舒迎花，何艷，2006.蒼耳等藥用植物提取物對小菜蛾的拒食作用和產卵忌避效果.中國蔬菜，(2):17－20］

Zhou Q，Wei MC，Liu BR，Yan YC，Wang WX，2007.Antifeedant and deterrent activity of different extracts from Xanthium sibiricum Patrin against insect pests.Plant Protection，33(6):81－85.［周瓊，魏美才，劉炳榮，晏毓晨，王問學，2007.蒼耳不同分離物對害蟲的拒食和忌避活性.植物保護，33(6):81－85］

Zhou Q，Wei MC，Ou XM，Zhong YH，Wang WX，2009.Antifeedant and deterrent effect of active fractions in Xanthium sibiricum leaf against insect pests and its chemical component.Journal of Plant Resources and Environment，18(1):74－79.［周瓊，魏美才，歐曉明，鐘義海，王問學，2009.蒼耳活性組分對害蟲的拒食和忌避作用及其化學成分.植物資源與環境學報，18(1):74－79］