豆粕固態發酵條件優化及發酵過程中細菌群落結構分析

吳逸飛 姚曉紅 王 新 孫 宏 錢 彬 張 博 湯江武

豆粕固態發酵條件優化及發酵過程中細菌群落結構分析

吳逸飛 姚曉紅 王 新 孫 宏 錢 彬 張 博 湯江武

以小肽含量為指標篩選出一株用于固態發酵豆粕的枯草芽孢桿菌（BSW-2），并對工藝條件進行了優化，最后通過變性梯度凝膠電泳技術（PCR-DGGE）探討了發酵過程中細菌群落的變化。結果表明：最佳工藝條件為接種量0.5%，料水比1：1.2，發酵溫度35℃，發酵時間36 h。在此條件下，發酵豆粕小肽含量從11.52mg/g提高到202.20mg/g，粗蛋白含量從47.65%提高到55.63%。PCR-DGGE結果表明，菌株BSW-2在整個發酵體系中均占有絕對優勢。

豆粕；枯草芽孢桿菌；固體發酵；小肽；PCR-DGGE；細菌群落

吳逸飛，浙江省農業科學院植物保護與微生物所，310021，浙江杭州。

姚曉紅、王新、孫宏、湯江武（通訊作者），單位及通訊地址同第一作者。

錢彬，衢州出入境檢驗檢疫局。

張博，株洲智薈生物科技有限公司。

豆粕是大豆經浸提脫油后的碎片狀或粗粉狀的副產品，其粗蛋白含量高，氨基酸組成合理，是目前使用最多、最廣泛的植物性蛋白質飼料原料[1-2]。肽是蛋白質降解的中間產物，由2個或2個以上的氨基酸以肽鍵相連。相對分子量在1～2 kD之間的肽稱為小肽[3]。大豆肽是大豆蛋白質經蛋白酶水解后得到的肽類混合物，以3～8個氨基酸組成的小肽為主。其氨基酸組成與大豆蛋白質相同，必需氨基酸含量豐富。大豆肽與大豆蛋白質相比，大豆肽消化吸收率較高，提供能量迅速，某些有生理活性的肽直接被動物吸收利用后，還具有免疫、神經遞質、抗氧化等活性[4-7]。動物采食的蛋白質經消化酶降解成游離氨基酸和各種小肽，游離氨基酸可以被動物直接吸收利用，而完整蛋白質或其降解產生的小肽也能被動物直接吸收，小肽具有與單個氨基酸不同的吸收機制，比單個氨基酸的吸收更有效[8-13]。

變性梯度凝膠電泳技術（PCR-DGGE）是一種根據DNA堿基序列的不同，在含有變性梯度的聚丙烯酰胺凝膠中將具有相同分子量的DNA分開的技術。選取細菌16S rDNA的V3區進行PCR擴增，再將PCR產物用于變性梯度凝膠電泳，電泳圖譜中的一個條帶就代表一個微生物物種，亮度代表該物種在整個環境中的含量[14-17]。

本研究擬篩選出具有較強蛋白降解能力細菌，并對其發酵工藝進行優化，使豆粕中的大分子蛋白得到較大程度的降解，提高小分子肽類的含量，最終提高豆粕的利用率和營養價值，同時采用PCR-DGGE方法分析豆粕發酵體系中細菌群落結構的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕：紹興中大生物科技有限公司提供，去皮豆粕，粗蛋白≥45%。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）12株，分別用 F3-1、F4、B1、BS1、BS2、BSIF、BSW-2、Ndt、KA、KB、ZCS、NBS表示，均為實驗室保藏菌株。

1.2 培養基

LB培養基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、水 1000m l，pH 值 7.0。

牛奶培養基：脫脂奶粉50 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，水 1000ml，pH 值 7.0。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌的篩選

將本實驗室保藏的12株枯草芽孢桿菌從甘油管取出，劃線于LB平板上，30℃培養24 h，待單菌落長出，挑單菌落接種于試管斜面，30℃培養24 h，于4℃保存。利用透明圈法篩選產蛋白酶菌株，將活化好的單菌落點種于牛奶培養基上，30℃培養24 h，可以觀察到明顯的水解透明圈，記錄下透明圈直徑和菌落的直徑。

將透明圈法篩選得到的菌株進行復篩，從試管斜面刮取1環接入20ml液體LB培養基，在30℃、160 r/min條件下搖瓶培養12 h，制成種子液；將種子液用于豆粕固體發酵，罐頭瓶裝料量100 g/瓶（干重），豆粕：水＝1：1.0，接種量2%，發酵溫度30℃，發酵48 h，發酵結束后將樣品于50℃烘干，粉碎過80目篩，測定小肽含量。

1.3.2 液體種子的制備

枯草芽孢桿菌經斜面活化后刮取一環接入20ml液體LB培養基，在30℃、160 r/min條件下搖瓶培養12 h，制成種子液。

1.3.3 豆粕基礎發酵方法

豆粕基礎菌酶協同處理條件為裝料量100 g/瓶、BSW-2接種量1%、料水比1：1、發酵溫度30℃、發酵時間48 h基礎上，豆粕以一定比例加水，接種，混合均勻后裝入罐頭瓶中，用8層紗布加報紙封口，放入培養箱中，設定溫度，在試驗設定的時間取出，50℃烘干，粉碎，過80目篩待測。

1.3.4 枯草芽孢桿菌豆粕發酵單因素試驗

1.3.4.1 接種量對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上，控制其他因素不變，分別接種0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的 BSW-2菌液進行發酵，發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.4.2 料水比對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上，控制其他因素不變，分別按料 水 比 1： 0.6、1： 0.8、1： 1、1： 1.2、1： 1.4、1： 1.6、1：1.8加水進行發酵，發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.4.3 發酵溫度對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上，控制其他因素不變，分別設定 30、35、40、45、50 ℃的溫度進行發酵，發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.4.4 發酵時間對小肽含量的影響

在基礎發酵條件上，控制其他因素不變，分別設定 0、12、24、36、48、60、72 h 的時間進行發酵，發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.5 枯草芽孢桿菌豆粕發酵工藝優化

根據單因素試驗結果，設計4因素3水平L9（34）的正交試驗進行發酵工藝優化。發酵結束經烘干、粉碎后測定小肽、粗蛋白含量，氨基酸組成分析，聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.3.6 PCR-DGGE方法分析豆粕發酵

1.3.6.1 樣品制備

裝料量100 g/瓶、BSW-2接種量1%、料水比1：1、發酵溫度 30 ℃分別在 0、12、18、24、30、36、42、48 h 的時間點處取樣裝入無菌封口袋中，-20℃保存待用。

1.3.6.2 細菌總DNA的提取及16SV3區PCR擴增

采用本實驗發明的方法提取豆粕樣品中細菌總DNA，采用上游引物GC+341(5'-CGCCCGCCGCGCG CGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG-3')下游引物 517R（5′-ATTACCGCGG CTGCTGG-3'）進行16S rDNA V3區PCR擴增。PCR產物做變性梯度凝膠電泳。

1.3.6.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

配制PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）凝膠濃度為8%（w/v），變性梯度為40%～60%(100%的變性劑包括42 g的尿素和40ml的甲酰胺)。在電泳槽中裝入7 L 1×TAE電泳緩沖液。取40%和60%變性溶液各15ml，分別加入 10%的過硫酸銨 160 μl、TEMED 13 μl，混勻，灌膠。小心插入梳子，讓凝膠聚合大約1 h，并把電泳控制裝置打開，預熱電泳緩沖液到60°C。取50μl體系PCR產物20μl,混入10μl上樣緩沖液，用注射進樣器上樣，在預熱60℃的1×TAE（20mmol/l Tris-Cl、10 mmol/l醋酸、0.5 mmol/l Na2EDTA） 和 40 V 電壓下，電泳50min，然后在120 V電壓下，電泳4～5 h。PAGE膠在EB染液中染色25 min后用TANNON－2500凝膠成像系統采集圖象。

1.3.6.4 回收條帶PCR

DGGE凝膠中的主要條帶切下后用dd H2O沖洗，搗碎后用30μl TE buffer在4℃浸泡過夜。回收條帶的PCR產物再次經DGGE檢測以確保回收條帶PCR產物的正確。PCR產物用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（由Sangon Corp.生產）純化后連入PMD18-T載體，轉入E.coli DH5a感受態細胞，采用菌落PCR檢測陽性克隆，每個樣品隨機挑選3個載有插入片段的陽性克隆送樣測序。

1.3.7 發酵樣品指標的測定

小肽含量測定：將待測樣品過80目篩，等體積加入10%三氯乙酸（TCA），在160 r/min搖床中培養30min，然后4000 r/min離心15 min，取上清液做適當稀釋后用Folin-酚法[18]測定蛋白質總量。

粗蛋白含量的測定：采用凱氏定氮法[19]。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的篩選

2.1.1 產蛋白酶枯草芽孢桿菌的初篩

根據菌株產蛋白酶的能力采用透明圈法進行初篩，菌落透明圈及比值λ（D/d）分別見圖1及表1。

圖1 菌落透明圈

由圖1和表1可知，除4株菌不產生透明圈外，其余8株芽孢桿菌都能在篩選培養基上形成明顯的水解透明圈。其中菌株BSW-2形成的透明圈直徑與菌落直徑的比值最大，說明其分解蛋白質的能力最強。選擇比值λ≥3.00的菌株進行復篩，分別為BS1、BS2、BSW-2、BSIF。

表1 透明圈直徑與菌落直徑之比

2.1.2 產蛋白酶枯草芽孢桿菌的復篩

將初篩得到的4株芽孢桿菌進行豆粕固體發酵試驗，各菌株發酵樣品小肽含量見表2。

表2 各菌株發酵樣品小肽含量

由表2可知，菌株BSW-2發酵樣品中小肽含量最高，達到108.10mg/g，優于其它菌株。結合初篩透明圈結果，說明菌株BSW-2降解豆粕蛋白質能力最強，因此選擇BSW-2作為豆粕發酵的菌株。

2.2 枯草芽孢桿菌BSW-2發酵豆粕的單因素試驗

2.2.1 接種量對小肽含量的影響(見圖2）

由圖2結果表明：當接種量為0.5%時，豆粕發酵后小肽含量最高，為191.04mg/g。隨著接種量的增大，小肽含量有所下降。

圖2 不同接種量對小肽含量的影響

2.2.2 料水比對小肽含量的影響(見圖3）

圖3 不同料水比對小肽含量的影響

固態發酵通過料水比來控制物料的水分，水分含量影響發酵過程中微生物的生長。由圖3的結果可知，小肽的含量隨著料水比的增加，呈現先增大后減小的趨勢，當料水比為1：1.2時，小肽含量最高，為197.76mg/g。當料水比過大時，小肽含量呈現減少的趨勢，可能是由于物料含水過多導致通氣性降低，從而影響此類好氧菌的生長，從而影響了蛋白質降解成小肽。

2.2.3 發酵溫度對小肽含量的影響(見圖4）

圖4 不同溫度對小肽含量的影響

溫度是影響發酵效果的重要因素，溫度過高或過低都不利于菌體生長，因此一個合適的溫度至關重要。由圖4的結果可知，當發酵溫度為30℃時，小肽含量最高，為161.23mg/g。隨著溫度的升高，小肽含量呈現下降的趨勢，在溫度為50℃，小肽含量最低。

2.2.4 發酵時間對小肽含量的影響(見圖5）

圖5 不同發酵時間對小肽含量的影響

由圖5的結果可知：隨著發酵時間的延長，小肽的含量呈先上升后略有下降的趨勢。當發酵時間為36 h時，小肽含量最高為177.29mg/g。隨著酶解時間的延長，小肽被進一步酶解生成游離氨基酸，含量反而出現下降趨勢。

2.3 枯草芽孢桿菌BSW-2發酵豆粕條件的優化

在單因素試驗的基礎上，得到各因素的適宜水平后，設計4因素3水平L9（34）的正交試驗進行發酵工藝優化，試驗因素水平設計、試驗設計及實施方案和結果見表3、表4。

表3 試驗因素設計

表4 試驗設計及實施方案與結果

2.3.1 正交試驗結果的直觀分析

從表4直觀分析可以看出，極差列中接種量因素的極差值最大，即接種量因素對小肽含量的影響最大，其次是發酵時間、發酵溫度、料水比。由均值分析得到各因素的趨勢見圖6。

圖6 各因素趨勢

由圖6可知，理論最優條件為A1B2C2D2，即接種量0.5%，料水比1： 1.2，溫度35℃，時間36 h。

2.3.2 優化條件的驗證

從正交表中觀察得知最優組合為2號A1B2C2D2，與理論最優條件A1B2C2D2相同。因此對此方案進行3次驗證試驗，測得小肽含量與粗蛋白含量，見表5。

表5 正交試驗驗證

由表5可知，驗正后的結果為：當接種量0.5%、料水比1：1.2、溫度35℃、時間36 h，發酵結束后小肽含量從11.52 mg/g提高到202.20 mg/g，粗蛋白從47.65%提高到55.63%。

2.4 PCR-DGGE方法分析發酵豆粕過程中細菌群落變化

提取發酵樣品細菌基因組總DNA，之后進行16S rDNA V3區PCR擴增，將PCR擴增產物用于變性梯度凝膠電泳，結果見圖7。

對圖7中標記的條帶A、B、C進行切膠回收，連接轉化后測序結果一致，且與芽孢桿菌BSW-216S rDNA相符，此結果證明了圖7與CK條帶處與同一位置的條帶都代表芽孢桿菌BSW-2。

由圖7可以看出，每個樣品中最亮的條帶在同一位置上，且與BSW-2在同一水平線上，可以說明從0 h開始芽孢桿菌BSW-2在整個發酵體系中都處于優勢地位。對比每個樣品的條帶個數可知，從0 h到48 h呈明顯的遞減趨勢。隨著發酵時間的延長，0 h中其它的幾個條帶慢慢消失，可以說明BSW-2的生長會抑制其它細菌的生長，到發酵后期整個發酵體系中，BSW-2占有絕對的優勢。

圖7 各樣品細菌16SrDNA V3區特征片段DGGE指紋圖譜

3 討論

PCR-DGGE技術是近年來新興的一項開展微生物分子生態學研究的工具。本研究采用了此技術分析發酵過程中細菌群落的變化，DGGE圖譜條帶的多少反映了分析樣品細菌種類的多樣性，條帶的亮度反映了其所代表的細菌在樣品中的生態位，亮度越高的條帶反映出該條帶代表的細菌在所分析樣品中占據優勢的程度越高。PCR-DGGE技術也存在一些缺陷，例如，在總DNA提取過程中，待測細胞是否充分裂解，一些抑制DNA降解的物質是否完全去除；在PCR擴增過程中，如何使所有模板以均等幾率被擴增；DGGE圖譜中的一個條帶是否就代表某一微生物等等。本試驗將DGGE圖譜中的條帶進行回收、轉化、測序來驗證特征條帶，因此試驗結果較為可靠。PCR-DGGE技術分析固體發酵過程中微生物群落變化，有助于更加深入了解整個發酵過程，從而為可能的固體發酵過程控制提供理論基礎。

4 結論

本研究篩選得到了一株能有效降解豆粕大分子蛋白的枯草芽孢桿菌BSW-2，并對其發酵豆粕的工藝進行了優化，結果表明最佳工藝條件為：接種量0.5%、料水比1：1.2、發酵溫度35℃、發酵時間36 h。在此條件下，豆粕發酵后小肽含量從11.52mg/g提高到202.20 mg/g，粗蛋白含量從47.65%提高到55.63%。PCR-DGGE結果顯示：BSW-2從發酵開始就在整個發酵體系中占優勢，隨著發酵時間的延長，BSW-2的生長會抑制其它細菌的生長，到發酵后期整個發酵體系中，BSW-2占有絕對的優勢。

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（編輯：劉 占，laramie_liu@yahoo.com）

S816.6

A

1001-991X（2011）16-0059-05

2011-07-10

浙江省重大科技專項[2006C120971]；杭州市重大科技專項創新專項資助項目[20092112A41]