RNA干擾及其在植物中的研究進展

張森浩，嚴學兵，王成章，文開新，許來俊

(河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002)

2006年10月2日，瑞典皇家卡羅琳醫學院的諾貝爾大會宣布，本年度諾貝爾生物醫學獎由美國馬薩諸塞醫學院的克雷格·梅洛(Craig C．Mello)教授和斯坦福大學醫學院教授安德魯·法爾(Andrew Z．Fire)分享，以表彰他們發現RNA干擾現象的貢獻[1]。RNA干擾是指外源或內源性的雙鏈RNA進入細胞后引起與其同源的RNA特異性降解，從而抑制相應基因表達，表現出特定基因缺失的現象，它與植物中的共抑制(co-suppression)或轉錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、真菌中的基因阻抑(quelling)一樣，均是生物體內普遍存在的一種生理機制[2]。RNA干擾現象普遍存在于動植物中[3]。在過去的20年，RNA干擾作為沉默基因表達的本能機制而出現，這種古老的抗病毒反應可以用來特定地抑制某種目的基因功能，RNA干擾正在成為一個非常有效的研究工具用于揭示許多基因的功能[4]。目前，有關RNA干擾機理尚未闡明，相關的研究主要集中在治療人類疾病和提高植物的性狀方面[5]。通過調查研究新秀桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、果蠅(Drosophilamelanogaster)及許多的無脊椎動物、植物[如擬南芥(Arabidopsisthaliana)]、真菌[如粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)，但不包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)]、老鼠胎兒期干細胞、卵母細胞及早期的胚胎等，發現了通過提供與所要沉默的基因序列一致的雙鏈RNA(dsRNA)可以從中中斷任何基因的表達[6]。

1 RNA干擾的發現

查爾酮合成酶基因CHS(chalcone synthase)與花色的關系密切，基因表達量的增加或減少都可能導致花色產生變異[7]。1990年，Napoli等[8]嘗試在有顏色的矮牽牛(Petuniahybrida)花翼瓣中通過介入CHS基因使查爾酮合成酶過量表達，來加深花瓣的顏色。出人意料的是，花瓣顏色不僅未加深，而且42%的介入CHS基因的植物的花全部變白或有白色或灰白圖案。當時他們稱之為基因的共抑(co-suppression)，并認為這種現象與甲基化作用(methylation)有關。在植物中，dsRNA可以在基因組的同源序列位點上誘導DNA發生甲基化[9]。甲基化是不對稱的，且不僅限于cpG或cpxpG序列，若甲基化發生在編碼區，對該基因座的基因轉錄無顯著影響，但是會引起轉錄后基因沉默；若發生在啟動子區，則誘發轉錄水平基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)，它與PTGS不同，具有穩定和可遺傳的特點[10]。1991年，Fire等[11]把RNA注入新秀桿線蟲以控制基因的表達。1992年，Romano和Macino[12]在粗糙鏈孢霉中發現外源基因的導入可以抑制具有同源序列的內源基因的表達，稱之為基因表達的阻抑作用。1995年，美國康奈爾大學的Guo和Kemphues[13]試圖利用反義RNA技術阻斷線蟲par-1基因的表達，出現了par-1基因關閉的現象。Waterhouse等[14]發現，在植物中雙鏈RNA分子能誘導PTGS的現象，證明在被病毒感染后，能同時產生與病毒基因組同源的正義和反義RNAs的植物比那些只能產生正義或反義RNA的植物能更有效地抵御病毒的入侵。在特定的生物學系統中把RNA導入到細胞中可以阻止內在基因功能的表達[15]。1998年，美國華盛頓卡耐基研究院的Fire等[16]在研究RNA干擾所需的結構和傳遞條件的試驗中發現，把dsRNA正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲體內，比注入單獨的任意一個正義鏈或反義鏈的效果均要好；把純化的正義或反義鏈注入成年動物體內效果較弱，然而雙鏈的混合物則產生強有力的、特定的干擾，這種干擾的效應不僅存在于被注入dsRNA的動物，在后代中同樣有效。實際上，每個受感染的細胞只需要很少分子的dsRNA便能引起足夠的效應來干擾內在同源基因(endogenous mRNA)的表達，并認為在干擾的進程中存在催化或放大作用，他們將這種現象命名為RNAi。

2 RNA干擾的過程

2.1RNA干擾的特點

2.1.1特異性 RNAi具有很高的特異性，只降解與其序列相應的單個內源基因的mRNA，而對不相關序列的表達無干擾作用。不同目的基因結構序列合成的dsRNA產生的效應存在顯著差異，外顯子序列的dsRNA能產生特異和高效的基因抑制，而只針對內含子序列的dsRNA則不能產生這種作用[17]。

2.1.2高穩定性 siRNA(small interfering RNA)分子是3′端有突出的非配對堿基的雙鏈分子，在細胞內可穩定存在3～4 d[18]，半衰期遠長于反義寡聚核苷酸；RNAi還具有對靶mRNA的切割位點的準確性和高穿透性等特點。

2.1.3高效性 RNA干擾抑制基因表達具有很高的效率，對目的基因表達的抑制可以達到缺失突變體表型的程度；而且數量相對很少的dsRNA分子(數量遠少于內源mRNA的數量)即能完全抑制相應基因的表達，許多生物學和遺傳學證據表明，RNA干擾效應中存在信號分子的擴增機制[16]。

2.1.4可傳播性和遺傳性 dsRNA分子能夠通過細胞膜、細胞間隙和細胞屏障而被轉運。如經線蟲小腸微注射或浸潤喂食線蟲的方法進入其體內的dsRNA能被有效轉運至全身各處，在各組織中對靶基因進行抑制，在體細胞和生殖細胞中都能檢測到RNA的表達，并且其子代也產生了對靶基因強烈而特異的抑制效應。說明RNA干擾機制中可能存在維持mRNA降解序列特異性的信號分子。但這種遺傳只限于子一代，子二代往往又回復到野生型[19]。Palauqui等[20]研究發現，轉基因引起基因沉默的植株可以通過嫁接從沉默砧木傳播到未沉默接穗上，通過將含有已沉默基因的植株嫁接到未沉默基因的寄主植株上，誘發寄主植株發生了RNA干擾。

2.1.5ATP依賴性 去除內源性ATP后，dsRNA對目的基因的抑制作用明顯降低或消失，而加入外源性ATP后，仍不能加強其抑制作用，顯示RNAi是一個ATP依賴的過程。Zamore等[21]認為，RNAi中至少有兩個過程需要ATP供能：一是dsRNA被Dicer酶酶切產生siRNA；二是siRNA與RISC結合解鏈后形成有活性的RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。

2.2參與RNA干擾的幾個重要因子

2.2.1Dicer酶 Dicer酶是一種ATP依賴性核酸內切酶，屬于RNase Ⅲ酶家族的成員之一[22]。Dicer酶能產生RNA干擾所必需的siRNA和miRNA(micro RNA)，這些小的RNA的特性由Dicer酶蛋白的結構決定；Dicer酶蛋白包括RNA HELICs、PAZ、RNase和dsRNA結合域。不同生物體具有不同數量的Dicer酶，各Dicer酶既有功能上的各自獨立，又有冗余和交叉。在進化過程中，Dicer酶的數量逐漸減少，卻逐步整合從而表現出更多功能[23]。

2.2.2小干涉RNA siRNA是通過Dicer酶或類Dicer酶從長的雙鏈RNA切割產生或通過化學途徑合成的，大小為21～25個核苷酸(nt)，siRNA可以與多細胞蛋白結合形成RISC[5]。

2.2.3RNA誘導的基因沉默復合物 RISC是一種核酸和蛋白質的復合物(包括蛋白質和siRNA)，可以將同源的mRNA分解成siRNA；RISC已經在果蠅和人類細胞中得到純化，而且都含有Argonaute蛋白家族的成員[24]，這種蛋白被認為是該復合物的核心成分[25]。Tabara等[26]的研究表明，Argonaute蛋白質RDE-1、QDE2和AGO1是RNAi過程中至關重要的成分，其作用與蠕蟲、果蠅和植物中的干涉過程類似。Argonaute及其同源蛋白質的分子量大約100 kD，稱為PPD蛋白質，均含有PAZ和PiWi結構域；PAZ結構域有一個很穩定的褶層和一個桶狀中心，側旁的附屬物能與長于5 nt的單鏈RNA和雙鏈RNA呈現很弱的結合[27]。

2.2.4RNA依賴的RNA聚合酶 RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP)在轉錄后基因沉默中起著重要作用。現已從植物中分離純化了RdRP，通過SDS-PAGE及天然條件下蔗糖密度梯度離心測定其分子量分別為128和115 kD，二者相差約10%，揭示RdRP可能是一種球狀蛋白[28]。實驗顯示，RdRP在無引物條件下也可以催化轉錄，其主要作用是放大RNA沉默信號，使雙鏈RNA得到擴增。目前已發現多種RdRP蛋白，如：SGS2/SDE1、RDR2、EGO-1、QDE-1等[29]。

2.3RNA干擾的機理 遺傳學和生物學的研究表明，RNAi是一個非常復雜的過程，涉及許多未知功能的蛋白質[30]。近年來的研究表明，長的雙鏈RNA在類似于RNaseln的Dicer酶的作用下，通過核酸內切作用，以ATP依賴的方式在胞漿中斷裂生成21～23 nt的siRNA分子，而具有發夾環結構、長度為70～80 nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)則被切割為21～25 nt的雙鏈miRNA；siRNA和miRNA的作用機理相似，與核蛋白粒子(RNPs)結合，分別形成siRNA核蛋白復合物和miRNA核蛋白復合物，然后重排為RNA誘導沉默復合物[31]。一般將含有siRNA的復合物稱為RISC，而將含有miRNA的復合物稱為miRNP[32]。復合物中只含有小RNA的一條單鏈，由于反義鏈(與靶RNA互補)的5′端熱力學穩定性較差，因此反義鏈形成復合物的機率較高，沉默效率也較高，該過程需消耗ATP[33]。siRNA為RNAi的觸發物(trigger)，稱為小干涉RNA，它是RNA干擾賴以發生的重要中間效應分子，siRNA的序列與所作用的目的RNA的序列具有同源性[22]。長的雙鏈RNA被切割成siRNA的過程中，Dicer酶起重要作用[34]。PAZ結構域首先識別雙鏈RNA分子3′端突出的2個單鏈堿基，起錨定作用，dsRBD結構域識別并結合雙鏈RNA分子5′端，與PAZ結構域聯合固定Dicer酶，最后在RNaseln活性域的作用下切割雙鏈RNA分子成siRNA分子。siRNA是RNAi的效應物，兩條單鏈末端具有5′磷酸基團和3′末端具有2 nt突出的非配對的堿基。這種結構對于siRNA有效地引發RNAi反應是相當重要的[22]。雙鏈siRNA與一種蛋白復合物相結合，這種蛋白復合物含有一個siRNA和一個蛋白核酸酶分子，在siRNA的指導下，蛋白復合物形成了一種有活性的RNA誘導的基因沉默復合體RISC，然后RISC中的siRNA引導沉默復合物識別靶向同源mRNA，接著RNA解旋酶完成靶向mRNA與siRNA正義鏈換位，在少量ATP參與的情況下，RNase在距離siRNA 3′端12 nt處切割靶mRNA，并使其降解，從而達到轉錄后基因沉默(PTGS)的結果[35]。哺乳動物中的RNAi主要以RISC為主，但植物中的RNAi還可以另外一種形式進行，即RNA依賴RNA聚合酶RdRP[36]。在RdRp介導的沉默中：首先，被導入的dsRNA直接與目標mRNA形成雙鏈，然后在Dicer酶的作用下形成siRNA，再進一步以siRNA的反義鏈為引物、目標mRNA為模板，在RdRP作用下發生類似PCR反應，形成新的dsRNA，新形成的dsRNA被Dicer再次切割形成siRNA，達到干擾目的基因表達的效果[37]。Simmer等[38]在裂殖酵母上的研究表明，RdRp(Rdp1)可以在體內從目標RNA模板合成RNA，產生的這些RNA不與發夾結構(hairpin structure)同源。

3 RNA干擾在植物中的誘導方法及載體構建

植物中RNAi的誘導方法包括農桿菌(Agrobacterium)介導法、粒子轟擊法、聚乙二醇(PEG)介導法、電擊穿孔法、病毒介導法(virus-induced gene silencing，VIGS)等[39]。農桿菌介導法快速、可靠、成本低，用于將dsRNA引入植物使基因沉默[40]，也是常用的RNAi的誘導方法；粒子轟擊法相對快速，但轉化效率較低；PEG 介導法及電擊穿孔法等已在多種不同種屬的植物中成功應用，但其周期過長不適于大規模鑒定基因功能。病毒介導的基因沉默是一種研究基因瞬時表達的新方法，它利用改造的病毒作為載體，這種改造的病毒無致病能力或只表現出很輕的病癥，并且能復制，把這種載體通過體外轉錄直接侵染植物或通過農桿菌介導、基因槍的方法，就可把目的基因序列導入宿主內，病毒便在植物內復制和傳播，從而誘導基因沉默[39]。

在植物RNA干擾的研究中，無論是驗證未知基因功能還是改良作物品質，構建相應的RNA干擾表達載體都是最基本的試驗步驟和必要方法，尤其是在應用RNA干擾技術進行作物品質改良時，要得到可穩定遺傳的轉基因植株，構建RNAi的表達載體必不可少：由于要誘發植物中的RNA干擾機制，必須要求導入的外源基因片段具有正反相連的RNAi結構。所以，構建高效的植物RNAi表達載體，對于RNAi技術在植物學領域的應用具有重要的推動作用[41]。用能夠表達產生dsRNA的質粒或病毒載體轉化植物，或者通過轉基因及病毒感染的方法在植物中過量表達單鏈RNA從而引起共抑制反應，都可以在植物中引發RNAi。其中利用T-DNA插入在植物中誘導產生RNAi的技術路線在擬南芥[42]和水稻(Oryzasativa)[43]等模式植物的功能基因組學研究中得到了較為廣泛的應用。該路線的原理如下：PCR擴增目標基因的cDNA片段，分別以正向和反向插入雙元植物表達載體，由強啟動子驅動轉錄，正反片段之間由一段載體上的內含子序列隔開以維持載體的穩定性；該系統在植物細胞中轉錄產生帶發夾結構的dsRNA，引發RNAi，從而抑制目的基因的表達[44]。

4 RNA干擾在植物中的研究進展

4.1在基因功能研究中的作用 在后基因組時代，人們迫切需要一種工具大規模地研究基因的功能。RNAi技術有逆基因分析的特點，通過特異地抑制靶基因的表達，獲得功能喪失或降低的突變體，進而找出該基因對細胞發育、分化及功能的相應聯系，同時對鄰近基因的結構、功能及表達無影響。RNA干擾在植物中被發現作為干擾核酸的機制而存在，例如通過小的(20～26 nt)RNA分子干擾病毒和轉基因的表達，也是植物的一種防御方式。近來研究發現，RNA干擾通過多種途徑發生，內源干擾途徑在基因轉錄、RNA的穩定性及翻譯水平上發揮了重要作用[45]。

2010年，Vaistij等[46]證明，在擬南芥中可以通過RNA干擾來抑制miRNA的積累；通過運用設計的靶向初級miRNA轉錄和啟動子的發夾RNAi結構，可以顯著地降低miR163和miR171a的積累；靶向的啟動子區域DNA的甲基化表明抑制miRNA初期的轉錄是可行的，可以實現miRNA表達的敲除，從而為打亂miRNA的目標配對和研究miRNA的功能提供了一個簡單的方法。在棉花(Gossypiumspp.)纖維中基因編碼的類成束蛋白-阿拉伯半乳聚糖蛋白質(fasciclin-like arabinoglactan proteins，FLAs)的作用通過構建RNA干擾體進行驗證；根據GhAGP4的序列的RNA干擾使mRNA的水平顯著下降，其他3個FALs蛋白則部分受到抑制；在轉基因植株中，纖維的初始長度和伸長受到抑制，成熟的轉基因棉花纖維的長度明顯變短并且纖維質量變差。對GhAGP4的RNA干擾影響了纖維細胞中纖維素的沉積。在培養過程中，GA3可以上調FLAs基因的表達，特別是GhAGP2和GhAGP4，結果表明FLAs基因對纖維的初始長度和伸長起著十分重要的作用[47]。康國章等[48]采用RT-PCR方法從小麥(Triticumaestivum)品種的發育籽粒中克隆出SSIII基因部分cDNA片段，并以pWM101質粒為基礎構建了由35S啟動子調控的SSIII基因的反義表達載體，還以pF6C5941質粒為基礎構建了SSIII基因的RNAi干擾載體，把這兩種載體導入小麥中，可降低或抑制SSIII基因的表達，通過分析轉基因小麥籽粒內支鏈淀粉組分的變化來研究SSIII基因在調控小麥支鏈淀粉合成中的作用。

RNAi技術能快速、高效、特異地使靶基因失活，從而可以非常有效地鑒定特定基因的功能，為解析植物基因的功能開辟了一條捷徑。研究鑒定植物中的優良基因或致病基因，可以給育種工作及減輕病害提供幫助，在農業生產上有指導意義。

4.2在抗病性研究中的作用 利用RNAi技術的原理，根據病毒的基因序列設計與之同源的dsRNA，導入到植物中，引發RNAi，可以對病毒進行特異性的切割，達到抑制病毒的作用。小麥條紋花葉病毒(wheat streak mosaic virus，WSMV)通過小麥卷葉纓螨(wheat curl mite)傳播，對美國和加拿大平原地區的經濟有很大影響。2010年，Fahim等[49]在澳大利亞發現了小麥條紋花葉病毒，該病毒在小麥種植區迅速傳播。由于在小麥體內很難找到抵御這種病毒的抗體，促使其通過基于RNAi的方法構建轉基因抗體。小麥可以和兩種質粒穩定地共轉化：表達包含WSMV序列的發夾RNA(hairpin RNA)的pStargate-NIa質粒和含有nptII選擇性標記的pCMneoSTLS2質粒。Southern印跡雜交分析表明，hpRNA整合到了小麥基因組中，而且來自hpRNA轉基因序列的小RNA的積累與免疫力呈正相關關系，證明通過這種技術產生非標記的WSMV免疫的轉基因植株是可行的，這是第一次在小麥中報告運用捻接內含子hpRNA表達的策略來對WSMV產生免疫。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是世界上廣泛種植的糧、菜、飼兼用型作物，在我國干旱、半干旱地區種植面積較大，但對病害比較敏感[50]。馬鈴薯中StRFP1基因抵抗晚疫病的功能已經通過表達和構建RNA干擾媒介進行了深入的研究，發現過表達StRFP1基因的植株致病比正常植株慢，用RNA干擾把StRFP1基因沉默掉則對病原體的感染敏感，證明StRFP1基因對抵抗馬鈴薯中的致病疫酶起著很重要的作用[51]。

棉花病蟲害是制約其產量和品質的重要因素之一，每年可造成大量減產。棉花曲葉病毒在巴基斯坦、印度等熱帶地區經常肆虐，減產和經濟損失嚴重，Asad等[52]通過構建含棉花曲葉病毒DNA的載體轉化煙草(Nicotianatabacum)表達病毒正義和反義的RNAs，結果25%的轉基因煙草顯示穩定的病毒抗性。姜洋等[53]通過農桿菌LBA4404介導，轉化攜帶pTiC58 T-DNA的煙草葉片，獲得攜帶正、反向吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)序列的轉基因植株，ELISA分析生長素的結果表明，轉基因植物葉片的內源生長素含量明顯降低，僅為pTiC58 T-DNA轉化植株的56%，說明轉基因煙草中發生iaaH基因轉錄后沉默，為利用該基因序列啟動RNA干擾、抑制冠癭瘤病發生提供了依據。對抗病毒轉基因煙草進一步研究發現了dsRNA和siRNA，說明轉錄后基因沉默是最有可能引起抗病毒的機制；這些研究為以后在棉花上應用RNAi進行抗棉花曲葉病毒研究指明了方向，也為其他抗病毒研究工作提供了有益的參考[54]。在植物的抗病性研究方面，通過RNAi技術，可以特異地抑制相應的致病基因，不僅保護了植物，在農業生產上也增加了收益。

4.3在遺傳改良研究中的作用 隨著生活水平的提高，人們對植物所提供產品的要求也越來越高，例如要求食物的主要營養成分含量更高且比例更平衡，抗營養成分更少。傳統的育種方法顯然不能完全滿足人們的需求，而RNAi技術的出現使一切成為可能。

利用RNAi技術可以改變花色。應用RNAi技術干涉與色素形成有關的基因，能誘導產生一些不同尋常顏色甚至花型的花，如日本和澳大利亞研究者利用RNAi沉默玫瑰(Rosarugosa)中二氫黃酮醇4-還原酶基因，培育出了藍色玫瑰[55]。Shoji等[56]在郁金香(Tulipagesneriana)花色試驗證明，TgVit1基因的表達和TgFER1基因的抑制對花被底部的藍色是至關重要的。

利用RNAi技術可以提高油酸含量。陳葦等[57]利用已獲得的甘藍型油菜(Brassicanapus)種子貯存蛋白——十字花科蛋白(cruciferin)基因的啟動子和終止子，構建了無選擇標記基因且同時具有正義和反義結構的油酰去飽和酶基因(Fad2)種子特異表達RNAi載體，并通過農桿菌介導轉化，獲得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表達受抑制的轉基因植株。RT-PCR分析結果表明，在油酸含量達83.9%的轉基因植株中未檢測到在非轉基因植株中普遍存在的Fad2基因轉錄mRNA——一種典型的RNA干擾現象，通過對植株生長發育狀態的觀察比較，該高油酸含量轉基因株系并未表現出雙突變體中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、發育遲緩、花蕾死亡、結實率低等不利的農藝學性狀。李蘭玉等[58]利用甘藍型油菜種子特異性貯存蛋白基因cruciferin啟動子及NOS終止子構建了無選擇標記基因且含有反義結構的油酸脫飽和酶基因的RNAi表達載體，通過農桿菌介導法，獲得了無選擇標記轉基因植株。再生植株的PCR檢測表明，外源基因已高頻率地整合到油菜基因組中，而且脂肪酸含量分析表明，獲得的轉基因種子油酸含量比對照有了很大的提高。錢春等[59]指出，纖維素酶、果膠裂解酶和伸展蛋白是參與草莓(Fragariaananassa)果實成熟軟化的關鍵因子，并提出了利用RNA干擾等生物技術對關鍵基因進行調控，降低相關酶的mRNA表達，提高草莓果實硬度從而延長保存時間的研究思路。

利用RNAi可以改善植物中營養物質的含量。Ogita等[60]利用RNAi技術抑制咖啡植物中編碼可可堿合成酶(CaMXMT1)基因的表達，轉基因植物中可可堿含量下降了30%～80%，咖啡因含量下降50%～70%。柴曉杰等[61]克隆了玉米(Zeamays)淀粉分支酶(starch branching enzymes，SBE)基因，構建了高效的siRNA表達體系，通過花粉管通道法導入玉米自交系，Northern雜交分析表明，該目的基因在轉基因植株中能正常轉錄并導致內源SBE mRNA含量下降，直鏈淀粉的含量提高了約50%。郭志鴻等[62]采用RNAi技術通過沉默內源Sbe 1和Sbe 2，獲得高直鏈淀粉含量的馬鈴薯。馬建等[63]的實驗證明，應用RNA干擾技術可有效抑制大豆(Glycinemax)籽粒中脂肪氧化酶基因表達，降低脂肪氧化酶活性，提高大豆脂肪含量，改良大豆品質，創造優良大豆種質。

利用RNAi還可以改良牧草。牧草種質資源是發展草地畜牧業的重要物質基礎，是篩選和培育優良牧草新品種的基本材料[64]。黑麥草(Loliumperenne)原產于亞洲和北非的溫帶地區，具有抗寒、耐踐踏、再生能力強、成坪快、營養豐富、生物產量高、可消化性高、適口性好等特點，成為我國最重要的冷季牧草之一[65-66]。Bhalla等[67]通過反義RNA技術，構建表達lolp5基因反義RNA載體，用基因槍將其轉入多年生黑麥草中，使lolp5基因表達受到抑制或表達下調，獲得可育的、該基因表達遭到破壞的、低致敏的轉基因黑麥草。Singh和Bhalla[68]通過引入突變使黑麥草花粉致敏蛋白結構折疊發生改變，而使花粉不能對人產生致敏的副作用。

5 RNA干擾存在的問題展望

RNA干擾技術被發現以來，盡管僅20年時間，但在植物上的發展相當迅速。目前該方面還存在一些問題需要進一步深入研究，如RNAi具體的作用機制、RISC的形成及作用機理、切割靶mRNA的過程、設計合成有效的siRNA、選擇合適的siRNA轉染試劑、構建有效的干擾載體等。此外，并非所有的RNA序列都能比較容易的接近siRNA、被識別、切割，有些靶序列可能隱藏在二級結構下，或者位于高度折疊的區域中，而有些序列可能與蛋白質形成緊密的復合物，阻礙了與siRNA的識別；一些與靶基因同源性高的基因可能會被沉默等。這些都有待于科研工作者進行更加深入的研究。令人興奮的是，RNAi與其他技術相比具有高效性、安全性和特異性，且操作簡單、成本低。隨著已知基因數目和EST(expressed sequence tag)測序項目的增加，人們對植物體基因組研究的深入和RNAi技術的不斷完善，RNAi在植物中的研究及應用前景將更加廣闊，也將在不斷的應用中進一步發展，同時給人們帶來更大的科研價值及經濟價值。

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