柴胡桂枝湯加味對大鼠抑郁模型行為學及海馬區神經生長因子及腦源性神經營養因子表達的影響

葛鑫宇 陳寶田 林曉春 于 林 杜念念 (南方醫科大學南方醫院中醫科，廣東 廣州 5055)

由于抑郁障礙具有高發病、高復發、高致殘的特點，不僅給患者及家屬生活質量帶來影響，而且給社會及家庭造成沉重的經濟負擔。傳統的三環類抗抑郁劑(TCA)和單胺氧化酶抑制劑(MAOⅠ)不良反應較大，且起效緩慢。新型抗抑郁藥物5-HT再攝取抑制劑(SSRⅠ)副作用小，如舍曲林、帕羅西汀等，但仍有胃腸道及神經功能等不良反應〔1〕。本研究以柴胡桂枝湯加味和舍曲林對照觀察大鼠抑郁模型行為學和神經生長因子(NGF)及腦源性神經營養因子(BDNF)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康雌性Wistar大鼠48只，鼠齡6～8 w，體重(200±20)g，由南方醫科大學實驗動物中心提供(scxk粵2006-0015)。按體重隨機分為正常組、模型組、柴胡桂枝湯加味高、中、低劑量組、舍曲林組，每組8只。造模方法采用慢性中等強度應激刺激模型(CMU)〔2，3〕，包括以下幾種不同的應激因子:光照(24 h)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、擁擠(24 h)、孤養(24 h)、游泳(5 min)。每種刺激隨機進行，使大鼠不能預料刺激的發生。造模時間為給藥7 d后連續3 w。給藥柴胡桂枝湯加味低、中、高劑量組分別給予濃度為29、58、116 g/ml柴胡桂枝湯加味藥液;西藥組給予舍曲林濃度為2.6 mg/ml混懸液。

1.2 藥物 柴胡桂枝湯加味組成:柴胡24 g、黃芩10 g、黨參10 g、半夏 10 g、生姜 10 g、大棗 10 g、甘草 10 g、桂枝 10 g、白芍20 g、生龍骨 30 g、生牡蠣 30 g、棗仁 15 g、遠志 10 g、合歡皮20 g、夜交藤70 g。水煎兩次，濾汁棄渣，合并藥液，共煎出400 ml藥液，含生藥量290 g。將藥液分別濃縮至濃度為29、58、116 g/ml冷藏備用。舍曲林(大連輝瑞制藥有限公司，國藥準字H10980141)用之前以雙蒸水配制成2.6 mg/ml混懸液。

1.3 曠場試驗(Open-field test)〔4〕觀察 將大鼠單獨置于高40 cm，底面邊長為100 cm的方柱體內。底面用黑線平均劃分為面積相等的25塊方格。以動物穿越方格塊數為水平活動等分，以站立次數為垂直得分。每只大鼠在給藥第28天進行一次測定，每次5 min。

1.4 樣品制備及測定 采用雙抗體夾心ABC-ELⅠSA法，用抗大鼠NGF、BDNF單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的大鼠NGF、BDNF與單抗結合，加入生物素化抗大鼠NGF、BDNF，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物標記抗生蛋白鏈菌素與生物素結合，加入酶底物OPD，出現黃色，加終止液硫酸，顏色變深，492 nm處測OD值，大鼠NGF、BDNF濃度與OD值呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中大鼠NGF、BDNF的含量。BDNF試劑盒購自于南京斯倍恩科技有限公司。

2 結果

2.1 曠場試驗得分 見表1。與正常組比較，模型組及各治療組水平得分明顯降低(P＜0.05，P＜0.001)，而各治療組較模型組有所改善(P＜0.001)。與正常組比較，模型組垂直得分降低(P＜0.001)，其他治療組較模型組有所改善(P＜0.001)。

2.2 海馬內NGF與BDNF 見表2。與正常組比較，模型組NGF、BDNF水平明顯降低(P＜0.001)，與模型組比較，西藥組及柴胡中、高劑量組NGF和BDNF含量明顯升高(P＜0.001，P ＜0.05)。與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.001;與模型組比較:3)P＜0.001

表1 各組大鼠行為學評分(n=8，±s)

表1 各組大鼠行為學評分(n=8，±s)

組別 水平得分 垂直得分柴胡桂枝湯加味低劑量組 51.88±10.8822) 11.88±3.2712)柴胡桂枝湯加味中劑量組 74.88±1.0512)3) 14.63±3.2921)柴胡桂枝湯加味高劑量組 98.38±14.5891)3) 18.75±2.9153)西藥組 96.75±15.6551)3) 19.00±2.6193)模型組 45.63±12.8942) 11.13±3.9442)正常組116.38±27.563 19.25±5.874

表2 各組大鼠海馬NGF和BDNF水平(n=8，±s，ng/ml)

表2 各組大鼠海馬NGF和BDNF水平(n=8，±s，ng/ml)

與正常組比較:1)P＜0.001;與模型組比較:2)P＜0.001，3)P＜0.05

組別NGF BDNF柴胡桂枝湯加味低劑量組 259.00±24.5991) 17.58±4.3731)柴胡桂枝湯加味中劑量組 304.37±36.9443) 25.37±6.7021)3)柴胡桂枝湯加味高劑量組 310.25±53.3073) 37.97±5.2302)西藥組 318.00±31.0483) 35.46±4.8032)模型組 221.12±47.6011) 18.32±6.1421)正常組337.87±52.015 40.38±7.951

3 討論

抑郁癥屬于中醫“郁癥”范疇。古代醫家有關郁癥的論述分為兩類，一是指一切人體氣血津液等瘀滯不通而生的疾病，即氣血津液之郁;二是專指情志抑悒憂郁的疾病，即情志之郁。而與抑郁癥關系最密切的應為情志之郁。情志疾病的概念最早源于《內經》，認為人的精神意識、思維活動，以喜、怒、憂、思、悲、恐、驚七種情志變化為其表現形式。外有所觸，則情有所變，內有所動?！秲冉洝钒亚橹疽蛩乜醋鲗е氯梭w致病的重要因素。認為七情五志的太過不及，特別是憂愁不解，直接影響臟腑功能的運轉和氣血津液的輸化，甚則氣機郁滯，產生病癥。本試驗選用小柴胡湯疏肝結郁，調節情志;桂枝白芍調和陰陽;佐以棗仁補肝、寧心安神，遠志安神益智，合歡皮、夜交藤養心安神〔5，6〕。故臨床上取得良好療效。

本研究采用中等強度慢性應激方法建立大鼠抑郁模型，經行為學評分測定，證實該模型基本模擬了抑郁癥患者的快感缺乏，興趣缺失，精神運動遲滯等抑郁表現。柴胡桂枝湯加味高劑量組在曠場試驗中水平得分和垂直得分較模型組有明顯改善，且與舍曲林組無顯著差異，證明該方有良好的抗抑郁作用。

海馬是邊緣系統重要組成部分，參與情緒、學習和記憶、行為、免疫等的調節，它的損傷在各種應激所致疾患中起到關鍵作用〔7〕。臨床和臨床前實驗研究表明海馬結構和功能的改變涉及抑郁癥的病理生理學過程，功能性影像學研究提示抑郁癥患者前額葉皮質、腹側紋狀體和海馬的體積減少〔8〕。尸檢表明抑郁癥患者在前額葉皮質存在神經膠質細胞及神經元數目的顯著減少，在海馬亞區存在突觸前標志物GABA能中間神經元的減少〔9〕。以上研究表明抑郁癥患者與海馬神經元細胞的丟失和海馬體積的減少相關聯。

NGF是第一個被發現、也是生物學功能了解得最清楚的一個神經營養因子。NGF對皮質、海馬、基底前腦的膽堿能神經元有神經營養作用〔10〕。在成年大鼠腦內，神經生長因子蛋白含量最高的部位是海馬，其次是皮質和嗅球;而NGF則廣泛存在于全腦，在海馬、新皮質和嗅球內NGF表達量最高〔11〕。

BDNF是神經營養素家族中的主要成員之一。研究資料表明BDNF與中樞神經系統神經元的生存以及多巴胺能、膽堿脂能、5-羥色胺能神經元的可塑性密切相關〔12〕。BDNF還可能通過對D3受體基因的表達調控，對神經元的增殖、分化和生存發揮作用，在神經精神疾病中起作用〔13〕。國內外的研究表明，即慢性應激的抑郁癥模型鼠的大腦(尤其是海馬)BDNF表達下調，經抗抑郁藥處理能使BDNF表達水平上升。說明神經營養因子參與神經元的可塑性和存活性，可能涉及抑郁癥的治療機制之一。神經營養因子表達水平下降參與了抑郁癥的某些病理生理過程，可能是抑郁癥的基本病理改變之一。本研究表明提示柴胡桂枝湯加味改善大鼠海馬內BDNF水平是治療抑郁癥的機制之一。

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4 Padilla E，Shumake J，Barrett DW，et al.Novelty-evoked activity in open field predicts susceptibility to helpless behavior〔J〕.Physiol Behav，2010;101(5):746-54.

5 吳海波，熊嘉瑋，陳寶田.安神方對失眠大鼠中樞氨基酸類神經遞質的影響〔J〕.熱帶醫學雜志，2009;9(6):628-30.

6 趙智勇，耿慧春，姚 兵，等.柴胡桂枝湯抗抑郁作用的實驗研究〔J〕. 中醫藥信息，2006;23(3):50-1.

7 Perry D，Hendler T，Shamay-Tsoory SG.Projecting memories:the role of the hippocampus in emotional mentalizing〔J〕.Neuroimage，2011;54(2):1669-76.

8 Niehusmann P，Seifert G，Clark K，et al.Coincidence detection and stress modulation of spike time-dependent long-term depression in the hippocampus〔J〕.J Neurosci，2010;30(18):6225-35.

9 Munoz A，Mendez P，Defelipe J，et al.Cation-chloride cotransporters and GABA-ergic innervation in the human epileptic hippocampus〔J〕.Epilepsia，2007;48(4):663-73.

10 Liu X，Wang D，Liu Y，et al.Neuronal-driven angiogenesis:role of NGF in retinal neovascularization in an oxygen-induced retinopathy model〔J〕. Ⅰnvest Ophthalmol Vis Sci，2010;51(7):3749-57.

11 Herrera DG，Maysinger D，Gadient R，et al.Spreading depression induces c-fos-like immunoreactivity and NGF mRNA in the rat cerebral cortex〔J〕.Brain Res，1993;602(1):99-103.

12 Klein AB，Trajkovska V，Erritzoe D，et al.Cerebral 5-HT(2A)receptor and serotonin transporter binding in humans are not affected by the val66met BDNF polymorphism status or blood BDNF levels〔J〕.JCereb Blood Flow Metab，2010;30(11):e1-7.

13 Sokoloff P，Leriche L.Drugs acting on D3 receptors in neuropsychiatric disorders:facts and prospects.Ⅰmplication for schizophrenia and its treatment in the regulation of BDNF-dependence on D3 receptor expression〔J〕.Encephale，2007;33(Pt 3):870-2.