還原型谷胱甘肽對糖尿病大鼠MDA和TAOC的影響

金開山 田海榮 秦文浩 (上海華東療養院，江蘇 無錫 4065)

還原型谷胱甘肽(GSH)是廣泛存在于生物體內的一種生物活性肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，含有巰基，是細胞內重要的還原劑，對過氧化物、自由基和親電子基起拮抗作用，能清除過氧化代謝產物，阻斷脂質過氧化反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用〔1，2〕。本研究通過觀察血清及心臟、肝臟、胰腺、腎臟組織勻漿中丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(TAOC)的變化，了解GSH對糖尿病(DM)大鼠抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性健康大鼠(150～170 g)50只，購自南通大學醫學院實驗動物中心。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma化學公司。GSH注射液(泰特，600 mg/支)購自香港銓福發展有限公司。魚精蛋白鋅胰島素(PZⅠ)購自上海第一生化藥業有限公司。Accu-Chek血糖儀及血糖試紙條由羅氏診斷產品有限公司提供。尿糖試紙為蘇州醫藥集團有限公司產品。糖化血清蛋白(GSP)、MDA、TAOC檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 取SD大鼠40只，禁食不禁水12 h，按65 mg/kg腹腔注射STZ(臨用前溶于0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，配成濃度為10 mg/ml，pH4.4)造模。另8只同齡大鼠腹腔注射6.5 ml/kg檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ后72 h測血糖＞16.7 mmol/L，尿糖3+～4+，持續2 d并出現多飲、多食、多尿，體重下降，確定DM模型成立。

1.2.2 實驗分組和處理 10只腹腔注射不含STZ緩沖液的同齡大鼠為正常對照組。DM大鼠成模32只，參照隨機血糖和體重分為3組:(1)DM對照組(n=11);(2)腹腔注射GSH(150 mg/kg，1次/d)的DM組(GSH組，n=11);(3)皮下注射PZⅠ(每天予 PZⅠ10～20 U/kg)控制隨機血糖在 4～8 mmol/L、尿糖陰性的PZⅠ組(n=10)。治療前測各組空腹血糖(FPG)。治療2 w后測四組大鼠FPG、GSP、MDA和TAOC。治療4 w后檢測四組大鼠FPG、GSP、MDA和TAOC以及心臟、肝臟、胰腺、腎臟組織勻漿的MDA和TAOC。

1.2.3 觀察指標檢測 通過裁尾法獲取一滴血，用Accu-Chek血糖儀及血糖試紙條檢測隨機血糖和FPG。用代謝籠收集少許尿液以尿糖試紙檢測尿糖。眼眥靜脈采血檢測血清GSP、MDA、TAOC。組織勻漿的制備及所有GSP、MDA、TAOC的檢測嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學分析 應用SPSS16.0統計軟件，計量資料以±s表示，單因素采用方差分析(ONE-WAY ANOVA)，組間比較采用 Student-Newman-Keuls法。

2 結果

2.1 FPG和GSP的變化 FPG治療前DM對照組為(15.86±0.689 4)mmol/L、GSH 組(15.92 ± 0.588 4)mmol/L，PZⅠ組(15.89±0.783 1)mmol/L，均顯著高于正常對照組〔(5.48±0.221 6)mmol/L，P ＜0.01〕，DM 對照組、GSH 組和 PZⅠ組之間無差異，表明DM大鼠分組均衡。2、4 w后FPG和GSP變化見表1。

2.2 MDA變化 2 w時GSH組、DM對照組血清MDA高于正常對照組(P＜0.01)，PZⅠ組與正常對照組比較無統計學差異，GSH組低于DM對照組(P＜0.05)。4 w時GSH組、DM對照組血清MDA高于正常對照組(P＜0.01)，GSH組低于DM對照組(P＜0.01)。DM對照組4 w時血清MDA較2 w時增高(P＜0.05)，但GSH組無此差異。4 w時DM對照組、GSH組心、肝、胰、腎組織 MDA均高于正常對照組和 PZⅠ組(P＜0.01)，GSH組除胰腺外，心、肝、腎組織MDA均低于DM對照組(P＜0.05)。見表2。

2.3 TAOC變化 2、4 w時GSH組、DM對照組血清TAOC均低于正常對照組、PZⅠ組(P＜0.01)，但GSH組與DM對照組比較血清TAOC增高(P＜0.05)。2 w與4 w時比較，GSH組、DM對照組血清TAOC無統計學意義。PZⅠ組2 w時血清TAOC低于正常對照組(P＜0.05)，但4 w時無統計學意義。

GSH組、DM對照組心、肝、胰、腎組織TAOC均低于正常對照組和PZⅠ組(P＜0.01)。GSH組除胰腺外，心、肝、腎組織與DM對照組比較TAOC均增高(P＜0.05)。而 PZⅠ組除胰腺TAOC仍低于正常對照組(P＜0.05)，心、肝、腎組織與正常對照組比較無統計學差異。見表3。

表1 四組大鼠血清FPG和GSP的變化(±s，mmol/L)

表1 四組大鼠血清FPG和GSP的變化(±s，mmol/L)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與2 w時比較:2)P＜0.05

組別 n FPG 2 w 4 w GSP 2 w 4 w正常對照組 10 5.08±0.388 7 5.26±0.472 0 2.08±0.144 5 2.06±0.158 8 DM對照組 11 18.83±0.648 61) 19.78±0.905 61)2) 4.04±0.403 91) 4.46±0.425 441)2)GSH組 11 17.80±0.762 31) 18.74±0.893 31)2) 4.08±0.223 71) 4.39±0.306 11)2)PZⅠ組 10 6.18±0.654 4 5.82±0.809 4 2.11±0.194 6 2.19±0.145 2

表2 四組大鼠血清和組織MDA含量的變化(±s)

表2 四組大鼠血清和組織MDA含量的變化(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與DM對照組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與2 w時比較:4)P＜0.05

組別 n 血清(nmol/ml)2 w 4 w組織勻漿(nmol/mgprot)心臟 肝臟 胰腺 腎臟正常對照組 10 5.05±1.304 3 5.26±0.753 8 4.01±0.177 5 2.44±0.350 7 0.43±0.312 2 7.14±0.522 1 DM對照組 11 11.53±2.319 61) 13.19±2.690 51)4) 8.36±0.296 61) 5.02±0.284 51) 1.22±0.186 41) 12.47±0.544 11)GSH組 11 9.74±1.436 31)3) 9.37±2.323 41)3) 8.09±0.159 21)3) 4.75±0.263 51)3) 1.16±0.415 81) 11.85±0.718 81)3)PZⅠ組 10 5.28±1.332 1 5.31±0.946 2 4.14±0.105 8 2.63±0.163 7 0.47±0.146 1 7.58±0.483 7

表3 四組大鼠血清和組織TAOC含量的變化(±s)

表3 四組大鼠血清和組織TAOC含量的變化(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與DM對照組比較:3)P＜0.05

組別 n 血清(nmol/ml)2 w 4 w組織勻漿(nmol/mgprot)心臟 肝臟 胰腺 腎臟正常對照組 10 8.68±1.050 3 8.74±0.894 2 0.50±0.057 4 1.26±0.127 1 0.85±0.226 0 1.12±0.222 9 DM對照組 11 4.78±0.596 11) 4.36±0.745 11) 0.27±0.104 51) 0.44±0.091 11) 0.28±0.058 91) 0.35±0.033 21)GSH組 11 5.46±0.760 31)3) 5.27±1.031 41)3) 0.38±0.125 11)3) 0.56±0.108 61)3) 0.33±0.076 91) 0.43±0.090 31)3)PZⅠ組 10 7.45±1.352 12) 8.02±0.837 4 0.48±0.152 5 1.17±0.080 7 0.69±0.084 62)1.05±0.266 4

3 討論

STZ是目前實驗中最常用于制備DM模型的試劑，可選擇性破壞大鼠胰島β細胞，使胰島素分泌減少，血糖增高。高糖狀態下，由于糖基化蛋白質的氧化、細胞質內醛還原反應、兒茶酚胺分泌增多與氧化增強、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的合成不足等原因致使體內氧自由基增高，引起多種氧化損傷;細胞膜多不飽和脂肪酸發生過氧化反應，形成脂質過氧化物(如MDA等)〔3〕。血清中的TAOC主要是血清中非酶促體系的抗氧化物質和酶促體系少數小分子量抗氧化物質的總和，是反映機體抗氧化作用的重要指標之一。高糖狀態下，TAOC也明顯減弱〔4〕。本研究中DM對照組、GSH組血清和組織MDA、TAOC的改變與這些結論相符。

有研究顯示，補充外源性還原型GSH能恢復GSH酶系活性，阻斷氧自由基對心肌的損害，可以預防、減輕、終止組織細胞損傷，改變病理過程，在保護心肌細胞方面具有良好的作用〔5〕。而且，GSH作為過氧化物酶的底物，能清除細胞內的過氧化氫及脂過氧化物，也可單獨與許多自由基如烷自由基、過氧自由基、半醌自由基等作用，是生物機體內的自由基清除劑，具有抗線粒體脂質過氧化作用，還可降低受損傷體系中線粒體膜膽固醇水平，使膜的流動性有所增加，起到保護肝臟、腎臟的作用〔6，7〕。本研究中GSH組血清和組織 MDA、TAOC的改變也與這些結論相符。

本研究結果顯示2、4 w時GSH組血清FPG和GSP與DM對照組變化一致，而血清MDA顯著降低、血清TAOC升高。在各種組織也表現為多數組織MDA降低和TAOC升高。這表明GSH引起的MDA和TAOC變化不是通過影響血糖來實現的，有其獨立的途徑。提示在DM治療中，抗氧化治療可作為治療內容之一。但4 w時GSH組血清MDA及TAOC與2 w時比較并無進一步顯著改變，其機制有待進一步研究。另外，不同濃度GSH對組織的影響可能不同〔7〕，就單個器官而言，其最佳藥物治療濃度也有待進一步研究。考慮到高血糖因素，本研究設計了血糖嚴格控制的PZⅠ組。由于GSP是評價DM患者取樣前2～3 w血糖控制情況的良好指標，不受血紅蛋白變異或其他可促進紅細胞更新因素的影響，評價、監控DM的療效迅速、靈敏、特異〔8〕，故以GSP來評價PZⅠ組血糖控制良好。PZⅠ組多數組織的MDA和TAOC能恢復至正常，提示胰島素治療不僅可很好控制血糖，同時可明顯提高機體的抗氧化能力。但在4 w時，即使完全糾正高血糖，也不能使某些組織(如胰腺)的MDA和TAOC恢復正常，是因為STZ對胰腺的損害難以逆轉，還是實驗的時間不夠長，有待進一步研究。

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