骨髓間充質干細胞移植對腦缺血模型大鼠記憶功能的影響

劉麗萍 那漢榮(吉林大學藥學院，吉林 長春 3002)

骨髓間充質干細胞(MSCs)能自我更新并具有多種分化潛能，近年來的研究發現間質干細胞可以橫向分化為外胚層起源的神經細胞〔1〕，進一步研究發現，將MSCs移植到局灶性腦損傷大鼠的腦內能存活、遷移，部分細胞分化為神經元和神經膠質細胞，并能在一定程度上促進腦功能恢復〔2，3〕，使其在神經系統疾病的應用前景更加廣泛。且其具有取材方便、體外培養易擴增、生物學特性穩定、免疫原性低及不受倫理道德的限制等優點，成為目前組織工程和再生醫學研究的一個新熱點。本研究擬通過體外培養擴增大鼠 MSCs，并將經DAPⅠ標記的MSCs注入缺血性腦損傷模型大鼠，觀察MSCs移植后在腦損傷大鼠腦組織中的遷徙、定居及對模型鼠學習記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和動物 DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(hyclone公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，DAPⅠ(Sigma公司)。5日齡健康Wistar乳鼠(8～10 g)及6周齡大鼠280～350 g由吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 BMSCs的分離、培養及鑒定 見參考文獻〔4〕。

1.3 MSCs的標記 取生長狀態良好的3代MSCs，注入前1 d進行標記。棄去MSCs培養瓶中的培養液，用PBS洗滌2次，加入DAPⅠ應用液，10 ml/瓶，置培養箱中1 h后棄去 DAPⅠ應用液，加入含胎牛血清的DMEM培養液，常規培養24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞標記情況。收集細胞備用。

1.4 動物模型制備 采用線栓法制備Wistar大鼠大腦中動脈缺血模型(MCAO)〔5〕。模型大鼠偏癱清醒后，可見右側肢體癱瘓，以前肢為重;表現為提尾時大鼠右前肢屈曲、內收，行走時向右側轉圈或傾倒、偏癱、肢體強直等，提示模型已成功建立。

1.5 DAPⅠ標記的MSCs細胞移植入腦組織 將上述DAPⅠ標記的MSCs濃度調整為1.0×104個/ml，經頸外動脈注入模型大鼠。于注入后24 h、第5天及第10天迅速斷頭處死大鼠，取損傷的一側大腦，組織包埋于OCT內，冰凍切片機切成2μm的切片，貼附于玻片上，室溫干燥10 min，丙酮固定10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 Morris水迷宮實驗 將實驗動物隨機分為正常組、模型組、PBS注入組及MSCs治療組。每組6只。手術過程中MSCs治療組將上述制備的未經DAPⅠ標記的MSCs單細胞懸液濃度調整為1.0×104個/ml，經頸動脈注入模型大鼠，PBS組經相同部位注入PBS。造模后2 w、8 w采用Morris水迷宮進行學習、記憶能力的測定，以大鼠逃避潛伏期代表學習記憶能力，測定方法同文獻〔6〕，逃避潛伏期越短，大鼠學習記憶能力越強。

1.7 統計學處理 采用SPSS12.0統計軟件包進行統計分析。用±s對數據進行統計描述。

2 結果

2.1 BMSCs的分離、培養及鑒定 通過全骨髓貼壁篩選法分離培養的第3代MSCs，形態呈長梭形;可以向成骨細胞及脂肪細胞分化;經流式細胞儀檢測CD44呈陽性，但CD34和CD45造血譜系標記則呈陰性。

2.2 MSCs在腦組織內的遷徒及定位 DAPⅠ標記的MSCs注入MCAO模型大鼠后，激光共聚焦顯微鏡觀察發現，注入后24 h，在損傷腦組織血管內出現熒光標記的MSCs;第5天，損傷組織血管及其周圍組織有標記的MSCs彌散;第10天，損傷組織內熒光標記的MSCs廣泛彌散。見圖1。

2.3 Morris水迷宮實驗時間結果 第2、8周時，經方差分析各組間大鼠逃避潛伏期有顯著性差異(P＜0.05)。進一步兩兩比較，模型組與PBS注入組無差異，而MSCs組與正常組、模型組之間相比有顯著性差異(P＜0.05)，MSCs組動物空間識別、記憶能力明顯強于正常組和模型組，而且MSCs組第8周與第2周結果也有顯著性差異(P＜0.05)，表明移植MSCs能有效提高缺血缺氧性腦損傷大鼠學習、記憶功能。見表1。

表1 大鼠Morris水迷宮實驗結果(±s，n=6)

表1 大鼠Morris水迷宮實驗結果(±s，n=6)

時間 正常組 模型組 PBS注入組 MSCs注入組 F值 P值2 w 22.31±2.96 107.73±9.34 108.62±6.34 53.71±8.78 20.02 ＜0.05 6 w 21.46±2.59 99.94±6.16 100.16±5.74 34.09±5.05 34.31 ＜0.05

3 討論

腦缺血性損傷后，中樞神經系統壞死的神經組織不能自然恢復。內源性神經干細胞雖然能啟動自發修復反應，但數量有限〔7〕。神經細胞損傷后的組織修復與功能重建一直是神經治療上的難題。瑞典神經病學家Picini等〔8〕從胎兒腦中分離神經組織細胞，植入帕金森病患者的腦內，發現一半以上患者的癥狀得到改善，而且療效持續存在。這充分說明神經細胞移植是治療神經系統疾病的有效手段。但是胚腦組織取材困難，應用受到倫理學和法律的制約，不可能推廣到臨床。與之相比MSCs具有強大的增殖能力和多向分化潛能，免疫原性弱，易于從骨髓中分離、純化及體外擴增，越來越受到人們的重視。

MSC應用于腦血管疾病治療的必要條件是其在腦內的成活并且增殖分化，這是其發揮治療作用的關鍵。Li等〔9〕將MSCs直接注入MCAO大鼠紋狀體內，28 d后觀察到MSCs成活并向缺血區遷移，說明腦缺血或壞死可作為誘導環境，或者腦缺血后可產生一種信息物質(很可能為炎性物質)，刺激MSCs擴增，然后遷移至腦缺血區域，參與修復腦缺血后的神經功能缺損。本實驗采用體外培養純化MSCs方法，純化擴增MSCs后，經頸動脈注入DAPⅠ熒光標記的MSCs 24 h后MSCs即出現在腦損傷區域血管內，第5天在血管周圍組織內開始彌散，第10天在損傷區域可見廣泛彌散，說明MSC治療缺血性腦損傷時能在腦中成活并向缺血部位遷移，參與血管組織修復。

Morris水迷宮是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計并應用于學習記憶腦機制研究〔10〕，該迷宮系統被廣泛運用在神經生物學領域的基礎和應用研究中，用以檢測大鼠的空間學習記憶能力，相對更為客觀。本實驗采用Morris水迷宮了解MSCs治療對MCAO大鼠學習記憶能力的影響，結果顯示，模型組大鼠學習記憶能力與假手術對照組大鼠相比明顯下降，進一步證實了MCAO大鼠模型制作成功。MSCs移植組大鼠逃避潛伏期縮短，空間學習能力明顯強于未移植組;說明大鼠的學習記憶障礙改善。Zhao等〔11〕將純化的人MSCs移植至腦缺血損傷部位，2～8 w后評價大鼠的感覺和運動功能并進行組織學研究，發現接受移植的大鼠在肢體平放實驗(limb placement test)中的功能明顯改善。Chopp等〔12〕多次將MSCs應用于腦外傷或腦缺血動物模型，發現MSCs大約有1%分化為神經元，5% ～8%分化為神經膠質細胞，并且能明顯促進神經功能恢復。Chen等〔13〕認為，MSCs能夠通過血腦屏障，到達腦損傷缺血區并分化為神經元和神經膠質細胞，修復缺損的神經組織。這些研究均說明，MSCs可在腦內成活，并可向受損部位遷移，促進神經功能恢復，其機制可能與MSCs合成部分細胞外基質、促進神經元恢復有關，但其調控機制尚不十分清楚，有待進一步深入研究。

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3 Mahmood A，Lu D，Chopp M.Marrow stromal cell transplantation after traumatic brain injury promotes cellular proliferation within the brain〔J〕.Neurosurgery，2004;55:1185-93.

4 朱 勇，陳良萬，林若柏，等.SD大鼠骨髓間充質干細胞體外培養、表型鑒定及標記〔J〕.吉林大學學報醫學版，2009;35(2):326-41.

5 陳佳俊，石巖殊，韓雪梅，等.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型(PMCAO)的實驗研究〔J〕.吉林醫學，2004;25:16-7.

6 陳羅西，郭玲玲，李 亮.Morris圓形水迷宮的應用及其相關檢測指標分析〔J〕.遼寧中醫藥大學學報，2008;10(8):55-6.

7 Phinney DG，Kopen G，Ⅰsaacson RL，et al.Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice:Variations in yield，growth，and differentiation〔J〕.J Cell Biochem，1999;72(8):570-85.

8 Picini P，Brooks DJ，Bjorklund A，et al.Dopamine release from nigral transplants visualized in vivo in a Parkinson patient〔J〕.Nat Neurosci，1999;2:1137-45.

9 LⅠY，Chopp M.Chen J，et al.Ⅰntrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2000;20:1311-9

10 Morris RG，Garrud P，Rawlins JN，et al.Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions〔J〕.Nature，1982;297(5868):681-3.

11 Zhao LR，Duan WN，Reyes M，et al.Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotype sanda meliorate neurological deficits after grafting into the isehemic brain of rats〔J〕.Exp Neurol，2002;174:11-9.

12 Chopp M，Zhang XH，Li Y，et al.Spinal cord injury in rat:treatment with bone marrow stromal cell transplantation〔J〕.Neuroreport，2000;11(13):3001-5.

13 Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats〔J〕.J Neurol Sci，2001;189(1-2):49-57.