黃精對阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織中Caspase-3表達的影響

馬鳳巧 (南陽醫學高等專科學校基礎部生理教研室，河南 南陽 473000)

目前阿爾茨海默病(AD)的防治已成為全球較為熱門的研究課題。黃精屬傳統中藥，有補中益氣，除風祛濕，安五臟延年等作用，近年來有較多文獻報道黃精具有提高記憶力的藥理作用〔1，2〕。本實驗以D-半乳糖致 AD大鼠模型，研究黃精對 AD大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達的影響，探討黃精提高AD大鼠學習記憶能力的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康SD清潔大鼠40只(由河南醫學動物實驗中心提供)，2～3月齡，體重(200±20)g，所有大鼠同室分籠標準條件下飼養。

1.2 方法

1.2.1 分組 在標準環境下適應1 w后，根據實驗設計將動物隨機分為對照組、模型組、黃精低、高劑量組，每組10只。但實驗后各組動物均有缺失。

1.2.2 藥品與試劑 黃精購于河南省南陽市醫藥公司;D-半乳糖購于上海試劑二廠，批號20050422;一抗:Caspase-3兔抗鼠抗體，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.3 給藥方法 模型組、黃精低、高劑量組用3%D-半乳糖生理鹽水溶液按150 mg·kg-1·d-1頸后部皮下注射，對照組皮下注射等量的生理鹽水;同時黃精高、低劑量治療組分別按10、5 g/kg的黃精水煎劑灌胃，模型組和對照組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.3 檢測方法 6 w后進行Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力和空間探索能力，實驗后將大鼠斷頭處死，在低溫冰盤上取出海馬組織，通過免疫組化(二步法)檢測海馬組織中Caspase-3蛋白的表達。采用DMR+Q550型病理圖像分析系統進行圖像分析，每組次選取8個視野，采用統一的照相倍數采樣，對其染色強度進行分析。

1.4 統計學方法 組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 黃精對AD大鼠學習記憶能力的影響 在Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期(EL)、撤離平臺后120 s內穿過原平臺象限內游泳距離占整個游泳距離百分比及空間探索次數，模型組與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.01)，黃精高劑量組與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)，說明高劑量黃精能提高AD大鼠的學習記憶成績，明顯改善AD大鼠的學習記憶能力。見表1。

2.2 黃精對AD大鼠海馬組織內Caspase-3表達的影響Caspase-3多數在胞漿表達，染色定位于胞漿，也可見于胞膜，陽性細胞反應呈黃色到棕褐色，沒有Caspase-3表達的細胞為陰性，被染為淡黃色者為弱陽性，被染為棕褐色者為強陽性。免疫組化檢測，光鏡下蘇木素復染后，對照組大鼠海馬組織神經細胞核呈淡藍色，胞漿和突觸不著色，未見Caspase-3蛋白表達，呈陰性。模型組大鼠海馬神經元中可見大量的棕黃色Caspase-3陽性表達產物，胞漿被染色為棕色，呈強陽性。用黃精煎劑灌胃進行干預后，低劑量治療組大鼠海馬神經元中Caspase-3的表達與模型組相比有所減少，被染為黃色，呈陽性。黃精高劑量組大鼠海馬神經元中Caspase-3蛋白表達極少，染色很淺，僅見個別為弱陽性。提示黃精對AD大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達有抑制作用，Caspase-3蛋白的表達隨黃精劑量的增大而減少。見圖1。

表1 黃精對AD大鼠水迷宮實驗的影響(±s)

表1 黃精對AD大鼠水迷宮實驗的影響(±s)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別 n EL(s) 所占距離的百分比(%) 探索次數(次/s)對照組 8 25.689 6±3.385 71) 34.865 0±6.624 51) 8.500 0±1.772 81)模型組 9 50.711 5±7.047 9 19.973 3±5.111 4 5.000 0±1.500 0黃精低劑量組 8 46.197 2±9.462 2 22.853 8±3.043 3 5.375 0±2.199 8黃精高劑量組 8 29.448 7±5.142 51) 34.208 8±4.671 31) 7.250 0±1.982 11)

圖1 各組大鼠海馬區Caspase-3表達(DAB，×400)

3 討論

研究表明，引起細胞凋亡的各種因素均應先激活半胱氨酰天門冬酸特異性蛋白酶(Caspase)才能誘發細胞凋亡，說明Caspase家族在執行和控制細胞凋亡的過程中發揮著非常重要的作用〔3〕，Caspase-3作為該級聯反應中共同的下游凋亡執行因子，執行死亡程序，因此 Caspase-3被稱為死亡蛋白酶〔4〕。Caspase-3可通過兩條途徑激活，一條是線粒體通道，生理或病理性刺激，使線粒體膜的通透性增高，釋放細胞色素 C，Caspase-9激活并切割Caspase-3，使之轉化為具有酶催化作用的活性形式;另一條為死亡受體通道，通過細胞表面的死亡受體(TNFaR1、FAS)，激活 Caspase-8，進而激活 Caspase-3〔5〕。近年來大量的研究表明，腦神經元對凋亡損傷極其敏感，這為AD進行早期干預、最大限度保護腦功能，從而減少海馬神經元凋亡和丟失，以預防AD的發生提供了可靠的理論依據。本研究結果表明Caspase-3與衰老大鼠海馬組織神經元的凋亡密切相關。黃精進行干預后大鼠海馬神經元Caspase-3蛋白的表達較模型組有所減少，且隨劑量的增加，Caspase-3蛋白的表達呈遞減趨勢。黃精治療AD的機制可能是通過某種途徑抑制Caspase-3的表達，減少海馬神經元的凋亡。黃精作為一種對AD的治療手段，為AD防治開辟了新的途徑，將會在臨床治療AD預防AD方面發揮重要作用。

1 李 銑，郭月英，孫隆儒，等.黃精改善小鼠學習記憶障礙等作用的研究〔J〕.沈陽藥科大學學報，2001;18(4):286-9.

2 石 林，蒙義文，李 偉.黃精及黃精多糖的藥理研究〔J〕.天然產物研究與開發，1999;11(3):67-71.

3 Saikumay P，Dong Z，Mikhailov V，et al.Apoptosis:definition，mechanisms，and relevance to disease〔J〕.Am JMed，1999;107(5):489-506.

4 李小明，宋天保.“殺手”蛋白酶Caspase〔J〕.細胞生物學雜志，2000;22(2):58-63.

5 Budihardjo Ⅰ，Oliver H，Lutter M，et al.Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis〔J〕.Annu Rev Cell Dev Biol，1999;15:269-90.