β2-腎上腺素能受體基因多態性與老年慢性阻塞性肺疾病合并高血壓的相關性

王 成 楊皚嵐 李 華 畢鴻雁 傅瑋萍 戴路明 陳 芬 譚 芳 符 琴 田陸云

(昆明醫學院第一附屬醫院老年病科，云南 昆明 650032)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)與高血壓(EH)都是一種發病機制復雜的疾病，環境和基因因素決定其發病和最終的表型。目前對COPD和EH基因易感性做了大量研究，在眾多候選基因中，β2-腎上腺素能受體(β2-AR)基因引起了廣泛重視。這個基因變化與支氣管及血管反應都有關，有可能與COPD合并EH有著重要遺傳相關性。本研究旨在闡明β2-AR基因多態性對COPD合并EH的發病是否有影響。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 各組受檢者均為無血緣關系的漢族人。①對照組60例，男50例，女10例，年齡(76.25±5.68)歲，均來自我院2009年3～7月健康體檢者，經肺功能等檢查排除了COPD、EH、哮喘、糖尿病及肝腎功能不良者。②COPD合并EH組60例，男47例，女13例，年齡(76.32±6.87)歲，均來自我院2008年9月至2009年7月住院病人，經病史、體檢、X線胸片或肺部CT及肺功能等相關檢查確診的COPD合并EH患者并排除了哮喘、繼發性高血壓、糖尿病及肝腎功能不良者。診斷符合我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)》及《2005年高血壓治療指南》。③COPD組60例，男49例，女11例，年齡(76.73±7.25)歲，來自我院同期的住院病人，經病史、體檢、X線胸片或肺部CT及肺功能等相關檢查確診的無高血壓的COPD患者并排除了哮喘、糖尿病及肝腎功能不良者。診斷符合我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)》。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 抽取外周血2～3 ml，以2%的EDTA抗凝，采用Promega DNA提取試劑盒提取外周血DNA。

1.2.2 PCR擴增

1.2.2.1 PCR擴增的引物設計 引物參照有關文獻設計〔1〕，采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(AS-PCR)方法，分別檢測β2-AR單核苷酸多態性Arg16Gly和Gln27Glu。擴增引物序列如下:Arg16Gly多態性，Arg16:5'-CTTCTTGCTGGCACCCAATA-3'，Gly16:5'-CTTCTTGCTGGCACCCAATG-3'，反 義 鏈 5'-CCAATTTAGGAGGATGTAAACTTC-3';Gln27Glu多態性，GLn27:5'-GGACCACGACGTCACGCAGC-3'，Glu27:5'-GGACCACGACGTCACG CAGG-3';反義鏈:5'-ACAATCCACACCATCAGAAT-3'。以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2.2 PCR擴增的反應體系及反應條件 反應總體系為50 μl，其中 DNA 模板 1 μl，dNTP(25 mmol/L)1 μl，Mg 離子(2.5 mmol/L)5μl，TapDNA聚合酶1 U，上下游引物各1μl和10×PCR Buffer 5μl。反應條件為;94℃預變性5 min;94℃變性2 min，16位點55℃退火1 min，27位點52℃退火1 min和72℃延伸1 min共35個循環;終末72℃延伸10 min。

1.2.3 Beta2-AR基因多態性的檢測 將AS-PCR的擴增產物加入含EB的1%的瓊脂糖凝膠樣品孔內，置于電泳槽中100 V電泳50 min，在紫外透射儀下觀察結果并攝像。根據各電泳道所顯示的電泳條帶判斷其基因型，如僅出現一條氨基酸電泳條帶則為純合子，出現兩條氨基酸電泳條帶則雜合子。

1.3 統計學分析 采用SPSS12.0統計軟件包，計量資料用±s或用四分位間距表示，組間頻率比較用R×C表χ2檢驗，多個組間計量資料的比較用單向方差分析及進一步的多重比較(LSD法)。

2 結果

2.1 β2-AR基因16、27位點基因多態性的檢測 見圖1和圖2。β2-AR基因16位點基因PCR擴增產物為913 bp，β2-AR基因27位點PCR擴增產物為420 bp。

2.2 各組一般臨床特點比較 見表1。COPD合并EH組及COPD組肺功能與對照組間差異顯著(P＜0.05)。

表1 各組間的一般臨床特點比較(±s)

表1 各組間的一般臨床特點比較(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05

組別 吸煙支數(支/年) FEV1% FEV1/FVC%COPD合并EH組 300 71.58±11.361) 57.16±8.901)COPD組 293 71.12±12.151) 56.88±9.131)對照組225 96.08±16.75 78.08±5.42

圖1 β2-AR基因16位點基因多態性的檢測

圖2 β2-AR基因27位點基因多態性的檢測

2.3 β2-AR 16、27位點等位基因頻率在不同人群的分布Gly16等位基因在云南漢族人群、中國北方漢族人群〔2〕、中國臺灣人群〔1〕中的頻率分別為36%、48%、40%，其在這三個群體中的分布差異無統計學意義(χ2=3.079，P＞0.05)。Gly16等位基因在云南漢族人群、歐洲人群、非洲人群中的頻率分別為36%、72%、50%，其在這三個群體中的分布差異有統計學意義(χ2=26.422，P＜0.05)。Glu27等位基因在云南漢族人群、中國北方漢族人群、中國臺灣人群、歐洲人群、非洲人群中的頻率分別為12%、36%、29%、50%和27%。其在各群體中的分布差異有統計學意義(χ2=15.969，35.114，P ＜0.05)。

2.4 各組β2-AR 16、27基因多態性分布 在云南漢族人群中，16位點ArgArg、ArgGly及GlgGly基因型頻率在對照組分別為40%、48%、12%;在 COPD合并EH組為47%、33%、20%;在COPD組為43%、42%、15%。其在三組中的分布差異無統計學意義(χ2=5.435，P＞0.05)。16位點突變等位基因頻率在對照組為36%，在 COPD合并 EH組為37%，在 COPD組為36%，其在三組中的分布差異無統計學意義(χ2=0.029，P＞0.05)。27位點GlnGln、GlnGlu及GluGlu基因型頻率在對照組分別為48%、10%、2%;在COPD合并EH組為53%、5%、2%;在COPD組為50%、8%、2%。其在三組中的分布差異無統計學意義(χ2=3.590，P＞0.05)。27位點突變等位基因頻率在對照組為12%，在COPD合并EH組為7%，在COPD組為10%，其在三組中的分布差異無統計學意義(χ2=1.451，P＞0.05)。

2.5 β2-AR基因16、27位點基因型與肺功能的關系 16位點ArgArg、ArgGly及GlyGLy基因型中FEV1值的差異有統計學意義〔(81.50±2.60)%，(68.28±4.43)%及(52.02±9.36)%，F=133.292，P＜0.05〕。進一步經LSD法比較:ArgArg與Arg-Gly組、ArgArg與GlyGly組、ArgGly與GlyGly組間的FEV1的差異均有統計學意義(P＜0.05)。27位點 GlnGln、GlnGlu及GluGlu基因型的 FEV1值的差異無統計學意義〔(71.70±11.64)%、(70.53±11.74)%及(72.85±2.33)%，F=0.048，P ＞0.05〕。

3 討論

本研究結果提示不同種族間Beta2-AR基因的SNP分布頻率存在差異，這種差異可能是導致不同種族Beta2-AR分布密度和受體反應性差異的原因之一。

目前對COPD和EH的流行病學、發病機制及自然病程仍不是十分清楚，但已經明確的是，兩者均是由環境與遺傳因素共同作用的多基因遺傳疾病。在眾多的候選基因中，因為β2-AR基因的變化與支氣管及血管反應性都有關，該基因逐漸引起了廣泛重視。Gly16變異型可增強長期使用β2-AR激動劑誘導的受體下調作用，而Glu27對β2-AR激動劑誘導的受體反應性下調有抵抗作用。Glu27純合子患者比Gln27純合子患者氣道反應性低，可能是由于Gln27β2-AR與循環中兒茶酚胺和外源性激動劑結合能下調β2-AR數目，而Glu27無此作用，因此Gln27個體具有更高的氣道反應性，而氣道高反應性是COPD患者呼吸道癥狀發生的危險因素。Ho等〔1〕研究提示Gly16等位基因增加COPD的易感性，而Gln27多態性在COPD組與對照組中的分布無統計學差異，但其與COPD的嚴重程度有關。曹霞等〔3〕研究表明β2-AR基因Gln27Glu基因多態性及單倍體可能參與COPD的發病機制。Melanie等〔4〕研究顯示Arg16純合子型與呼吸道的氣喘癥狀有關，并會增加患COPD的風險，而Gln27純合子型與呼吸道的氣道高反應性(BHR)有關，會增加患哮喘的風險。提示 Arg16Gln27單倍體型與COPD、BHR和哮喘有密切關系。Bregger等〔5〕研究 Arg16Arg和Gln7Glu的基因多態性與COPD的發病無關。而Ranade等〔6〕研究顯示Gly16等位基因與我國人群EH的關系密切，Gln27Glu基因多態性與EH的關系不明顯。朱建等〔7〕研究表明對我國漢族人群而言，Beta2-AR16位點多態性基因型頻率和正常血壓人群無統計學差異，而Gln27純合子型在高血壓組明顯高于正常血壓人群，并提示Gln27純合子型患EH的危險性比對照人群高2倍以上。

本研究提示Gly16等位基因的存在增加肺功能的損害，而27位點基因多態性與肺功能無關。該結果與Ho等〔1〕的部分研究結果相同。雖然我們未發現β2-AR基因27位點基因多態性對FEV1的顯著性影響，但可能與檢測到的該位點變異例數較少，未達到統計方法的判別范圍有關。

本研究的結論是β2-AR基因16、27位點基因型多態性的分布在不同族群中存在差異，提示族群對基因突變可能有一定影響。在本研究人群中，β2-AR基因16、27位點基因多態性與COPD合并EH的易感性可能無相關性，但16位點的基因多態性與肺功能可能有關，在某種程度上影響疾病的嚴重程度。上述研究結果與以往研究存在不一致的原因可能是:一是COPD和EH的易感性不但受遺傳因素的影響，還受到其他因素如吸煙、環境污染、氣候等的影響，在我們的研究人群中，β2-AR基因多態性的影響可能被其他影響因素降低。二是COPD和EH作為多基因疾病，其具有遺傳異質性，COPD和EH患者遺傳背景的不同，可能引起研究結果的不同。三是從樣本數量上看，這些研究都只是一些初步工作，需進一步擴大樣本進行更深入研究。

1 Ho LⅠ，Harn HJ，Chen CJ，et al.Polymorphism of the beta2-adrenoceptor in COPD in Chinese subjects〔J〕.Chest，2001;120(5):1493-9.

2 高光凱，蔣一平，王士雯.中國北方漢族人群beta2-腎上腺素能受體基因多態性研究〔J〕.中國優生與遺傳雜志，2002;10(1):18-20.

3 曹 霞，李清泉，陳國忠，等.慢性阻塞性肺病患者ⅠL-4、ⅠL-13以及ADRB2基因多態性的檢測〔J〕.武漢大學學報(醫學版)，2009;30(2):219-23.

4 Melaine C，Matheson A，Johns E，et al.beta2-adrenergic receptor polymorphisms are associated with asthma and COPD in adults〔J〕.Hum Genet，2006;51(11):943-51.

5 Bregger J，Steen VM，Eiken HG，et al.Genetic association between COPD and polymorphisms in TNF、ADRB2 and EPHX1〔J〕.Eur Re-Spir，2006;27(5):682-8.

6 Ranade K，Shue WH，Hung YJ，et al.The glycine allele of a glycine/Arginine polymorphism in the beta2-adrenergic receptor gene is associat-Ed with essential hypertension in a population of Chinese origin〔J〕.Am J Hypertens，2001;14(10):1196-200.

7 朱 建，江時森，曹 文，等.中國漢族人中beta2-腎上腺素能受體基因多態性與高血壓病的關聯性研究〔J〕.醫學研究生學報，2003;16(2):123-6.