改變血紅素加氧酶-1水平對糖尿病大鼠氧化應激狀態及腎功能的影響

邢邯英 野戰鷹 張冬會 付玲娣 裴華穎 (河北省人民醫院老年醫學重點實驗室,河北 石家莊 050051)

氧化應激在糖尿病腎病(DN)的發生和發展中起重要作用,高血糖誘導的活性氧產生增多是糖尿病(DM)血管并發癥包括 DN在內發生的主要因素。血紅素加氧酶-1(HO-1)被證實是重要的生理性氧自由基清除劑,體外實驗表明,在嚴重缺氧情況下,其抗脂質過氧化的能力優于維生素 E,被認為是最佳的抗自由基物質?？梢?HO-1是細胞的一種內源性保護蛋白,那么激活的HO-1通路是否可以起到對抗 DM腎臟氧化損傷的作用呢?本實驗復制了 DM大鼠模型,觀察 HO-1的誘導劑正鐵血紅素(Hemin)和其抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)對 DN大鼠腎功能和氧化應激狀態的影響,探討HO-1與 DN的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 鏈脲佐菌素、Hemin、ZnPP均購自美國 Sigma公司;逆轉錄酶為Promega公司產品;血清總抗氧化能力(TAOC)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物試劑公司。PCR擴增體系為北京賽百盛基因技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠模型的制備和分組 將雄性 SD大鼠隨機分成 4組:①生理溶劑對照組;②DM組:大鼠按 50 mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素以誘導 DM,于模型成功后 5 w,10 w和15 w處死動物;③Hemin組:確認 DM大鼠模型成功后每日腹腔注射 Hemin 30μmol/kg,連續 5 w;④ZnPP組:確認模型成功后腹腔注射 ZnPP 10μmol/kg,連續 5 w。

1.2.2 血清 TAOC和 MDA含量測定 全血 4℃離心3 000 r/min,10 min。取血清分裝待測。按試劑盒說明操作。

1.2.3 尿白蛋白排泄率(UEA)檢測 留取 24 h尿液-20℃冰箱保存待測 UEA。

1.2.4 RT-PCR技術檢測腎臟 HO-1、TNF mRNA表達 取各組大鼠腎組織,Trizol一步法提取總 RNA,在逆轉錄酶催化下合成 cDNA。HO-1的上、下游引物分別為:5′-CTG GAA GAG GAG ATA GAG CGAA-3′,3′-TCTTAG CCT CTT CTG TCA CCCT-5′,擴增產物全長 433 bp;TNF-α的上、下游引物分別為:上游 5′-CGA GTGACA AGCCCG TAGCC-3′;下游為 :5′-GGA TGA ACA CGC CAG TCG CC-3′,擴增產物全長 255bp。以 β-actin作為內參。擴增產物進行 1.5%瓊脂糖電泳,UVP凝膠顯像儀掃描并進行圖像分析。用目的基因的吸光度與β-actin吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。

2 結 果

2.1 血清 TAOC與 MDA含量的變化 與對照組血清 TAOC相比,5、10、15 w DM大鼠血清 TAOC均下降,并且有時間依賴性(P均 ＜0.01);MDA含量則逐步上升,10、15 w DM大鼠MDA含量較對照組明顯增高(P＜0.01);Hemin組血清TAOC雖仍低于對照組水平(P＜0.05),但是與 DM組大鼠相比明顯增高(P＜0.05);而給予 ZnPP后 DM大鼠 MDA含量進一步增加,TAOC繼續降低,與 DM組相比均有顯著差異(P＜0.05)。見表 1。

表1 各組大鼠 TAOC及 MDA含量的變化(±s)

表1 各組大鼠 TAOC及 MDA含量的變化(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05,2)P＜0.01;與 5 w DM組比較:3)P＜0.05

組別 TAOC(U/ml) MDA(nmol/L)對照組 8.84±0.81 4.56±0.28 DM組 5 w組 6.24±0.872) 5.63±0.52 10 w組 5.32±0.912) 6.82±0.472)15 w組 4.02±0.912) 8.13±0.892)Hemin組 7.22±0.121)3) 5.53±0.52 ZnPP組 4.33±0.442)3) 7.51±0.492)3)

圖1 各組 TNF-α及 HO-1m RNA的 RT-PCR擴增結果

2.2 UEA比較 與對照組相比,5、10、15 w DM大鼠 UEA均上升(P均 ＜0.01),并隨病程延長而加重;Hemin組與 DM 5 w組相比已有下降趨勢,但尚無統計學差異(P＞0.05);ZnPP組大鼠 UEA明顯增高,與對照組及DM 5 w組相比,均有顯著差異(P＜0.01)。

2.3 HO-1與 TNF-αmRNA在各組腎臟組織的表達 見圖 1。對照組 HO-1/β-actin的 IOD比值為(46.52±11.56)%,病程5 w的DM大鼠 HO-1表達明顯上調,IOD比值達到(67.10±12.18)%,兩者相比有顯著差異(P＜0.01);Hemin組 HO-1表達量為(102.17±9.04)%較對照組和 DM組均升高(P＜0.01)。ZnPP組 HO-1表達量為(62.96±15.11)%與 DM組無差異。與對照組 TNF-αIOD值(21.13±5.69)%相比較,DM組 TNF-α/β-actin的 IOD比值明顯增高(49.42±4.17)%,Zn-PP組(55.71±12.83)%與 DM 5 w組 TNF-α表達無統計學差異,但是應用 Hemin后 DM大鼠腎臟組織 TNF-α表達減少〔(32.89±7.45)%,P＜0.01〕。

3 討 論

本實驗成功復制了DM大鼠模型,在病程早期大鼠就表現了典型的“三多一少”癥狀,即多飲、多尿、多食和體重減少;5 w DM大鼠 UEA明顯高于對照組,形成腎臟損傷,并隨病程時間的延長,UEA升高程度增加,表明DN損傷加重。

HO-1可被多種氧化應激因素所誘生(如內毒素、高氧、低氧、紫外線、重金屬和血紅素等)〔1～3〕,是目前所知最易受誘導的酶之一,所以有研究者認為 HO-1可能是機體的一種自身保護性蛋白,是組織細胞對抗氧化應激的重要組成部分。近來有關 HO-1與 DM及其并發癥的研究備受重視,并已取得一些成果。Hayashi等〔4〕已證實 DM大鼠腎小球上皮細胞、系膜細胞和毛細血管內腔 HO-1mRNA和蛋白表達增高,應用維生素 E或丙丁酚進行治療的 DM大鼠的 HO-1表達和正常無異,活性氧的含量變化與 HO-1的變化一致,提示HO-1對抗DM腎病的氧化損傷。我們正是基于以上的研究成果,將 HO-1與 DN的研究繼續深入。

本實驗在 DM大鼠病程的中晚期觀察到血清 MDA含量明顯增加,這是體內氧化應激反應造成脂質過氧化的證據,同時在病程早期即發現了血清TAOC下降,說明機體抗氧化系統功能也已受損,以上結果強烈提示抗氧化治療的必要性,且應用Hemin后可增加 DM大鼠的 TAOC,降低 MDA水平;UEA有下降趨勢,雖沒有統計學意義,但 UEA是判斷 DN的敏感指標,UEA的變化說明腎臟損傷有緩解。因觀察時間有限,有可能隨著時間的延長會有統計學結果的顯示。而在連續給予HO-1抑制劑 ZnPP后 TAOC下降,MDA含量和 UEA在 DM早期就增高,同樣提示抑制HO-1可以損害機體的抗氧化系統,加重腎臟病變和功能紊亂。TNF-α是一重要的前炎性因子,本實驗中觀察到應用 Hemin可以降低TNF-α的表達水平,但這種作用是繼發于 HO-1對氧化應激的削弱還是對 TNF-α的直接作用仍有待進一步的研究。我們推測Hemin預處理可以使HO-1表達顯著增強,延緩DN的進程。結合Hemin對腎臟功能的保護,抗氧化途徑應是 HO-1對抗DN功能障礙的機制之一。

本部分實驗僅觀察到改變HO-1水平對DM大鼠機體氧化應激狀態及腎功能的影響,但缺乏直接的證據證實這種保護作用是由 HO-1分解血紅素后何種代謝產物介導的或是各種產物的綜合作用,深入研究各產物對 DM病變發生、發展的作用將是今后研究的方向。

1 徐金金,王 龍.異丙酚對大鼠心肌細胞氧化損傷時血紅素加氧酶-1表達的影響〔J〕.華中科技大學學報,2009;38(6):760-3.

2 Carraway,MS,Ghio AJ,Carter JD,et al.Expression of heme oxygenase-1 in the lung in chronic hypoxia〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2000;278(4):L806-12.

3 Lee,PJ,Alam J,Wiegand GW,et al.Overexpression of heme oxygenase-1 expression in human pulmonary epithelial cells results in cell growth arrest and increased resistance to hyperoxia〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(19):10393-8.

4 Hayashi K,Haneda M,Koya D,et al.Enhancement of glomerular heme oxygenase-1 expression in diabetic rats〔J〕.Diabetes Res Clin Pract,2001;52(2):85-96.