原癌基因 Pim-3蛋白表達與食管癌術后生存的關系

寇 煒 趙 晉 吳 靜 竇春江 顧巧玲 (西北民族大學醫學院,甘肅 蘭州 730030)

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,也是我國常見的一種惡性腫瘤,甘肅省食管癌高發區域主要集中在河西地區,其中以武威地區檢出率最高。而初診患者多為中晚期病人,外科手術后患者生存率也較低。為了做到對食管癌初診患者的早期診斷和判斷預后,以提高患者的存活率,有必要對食管癌的腫瘤標記物進行檢測。近年來癌基因絲/蘇氨酸激酶前病毒整合位點(Pim)家族成為研究的熱點,其家族成員 Pim-1、Pim-2〔1〕已被證實是細胞生物通路中的關鍵分子。國內外研究者在肝癌、胰腺癌、結腸癌領域〔2～4〕對 Pim-3基因的研究已有較大的進展,但在食管癌中對Pim-3基因的研究報道尚不多。本研究旨在用免疫組織化學鏈菌素-生物素-過氧化物(SP)法探討50例食管癌患者 Pim-3的表達及病理學特征與食管癌患者術后生存關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取我院病理室 2005年 1月至 2008年 12月 85例食管癌根治術后的標本。全部病例均有完整臨床資料。術前均無放療、化療及其他抗癌治療史。并術后隨訪其中 50例(隨訪方式包括門診、電話隨訪以及信訪)。病理類型:均為鱗癌。所有標本均經甲醛溶液固定,石蠟包埋,連續切片,厚度4μm。山羊抗人 Pim-3多克隆抗體購自美國 Sigma公司,DAB試劑盒、SP試劑盒由北京中杉公司提供。

1.2 方法 免疫組織化學法嚴格按照S-P試劑盒進行操作。

1.3 結果判斷標準 Pim-3陽性染色標準:以細胞質呈現棕黃色表達為主。評分標準:采用雙評分半定量法評分,＜25%癌細胞陽性為 0分;25%～50%癌細胞陽性為 1分;51%～75%癌細胞陽性為 2分;＞75%癌細胞陽性為 3分。顯色度按切片中細胞顯色有無及深淺評分:細胞無顯色為 0分,淺黃色為 1分,棕黃色為 2分,棕褐色為 3分,然后將兩個評分相加,1～2分+,3～4分?,5～6分?。用 PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 統計學分析 各相關指標之間進行 Spearman等級相關分析。用 Kaplan-Meier法統計食管癌患者各項臨床指標對其預后的影響,顯著性檢驗采用時序檢驗(Log-rank test)。建立Cox回歸多因素模型分析(Forward法),篩選出對食管癌預后的諸多影響因素。

2 結 果

2.1 Pim-3基因在不同組織中的表達 Pim-3蛋白陽性信號呈棕黃色,主要定位于細胞質,少許定位于細胞膜;大部分癌旁組織 Pim-3蛋白呈陰性表達。

2.2 Pim-3基因表達與食管癌預后的關系 對 85例食管癌的病人隨訪 50例,其中存活 3年者為 12例,存活率 24%。隨訪者中 Pim-3陽性者 39例,存活 3年以上者 5例,存活率 12.8%,Pim-3陰性者 11例,存活 3年以上者 6例,存活率 54.5%,兩者相比有顯著的差異(P＜0.01);即:Pim-3陽性者其 3年存活率要明顯低于其陰性者。

2.3 各項指標對食管癌患者預后的影響及生存分析 采用Kaplan-Meier法,統計食管癌患者各項臨床指標對其預后的影響并繪制生存曲線分析,采用時序檢驗(Log-rank test)發現:食管癌患者的年齡、病理分級、臨床TNM分期、Pim-3表達、侵襲深度及淋巴結轉移與否是影響患者預后的重要因素。年齡小于 50歲的患者平均生存時間高于 50歲以上的平均生存時間(P＜0.05);病理分級為Ⅰ ～Ⅱ級者平均生存時間要高于Ⅲ級(P＜0.01);臨床 TNM分期中Ⅰ ～Ⅱ期的患者平均存活時間要高于Ⅲ期和Ⅳ期(P＜0.01),Ⅲ期的要高于Ⅳ期(P＜0.01);Pim-3表達陽性者,其平均存活時間低于陰性者(P＜0.01);無淋巴結轉移者的平均存活時間明顯比有淋巴結轉移者存活時間延長(P＜0.01);另外癌組織侵襲至肌層的患者平均存活時間比侵襲至外膜層患者的平均存活時間要長(P＜0.01);同時還發現患者術后平均存活時間與性別、腫瘤大小、病理類型無相關性(P＞0.05)。見表 1。

2.4 Cox回歸多因素模型分析及 Pim-3基因不同表達患者的生存曲線 采用 Forward法分析:食管癌的病理分級、TNM分期、Pim-3基因表達是獨立的預后因素,其中以病理分級、Pim-3基因表達最為重要,且病理分級〔Exp(B)=3.858 8〕和 Pim-3〔Exp(B)=6.132 5〕是危險因素。同時,Pim-3不同基因表達明顯影響食管癌患者的生存期。見表 2,圖 1。

表1 50例食管癌患者單因素生存分析(Kaplan-Meier法)

表2 Cox回歸多因素模型分析出與預后相關的危險因素

圖1 Pim-3不同表達患者的 Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

眾所周知惡性腫瘤的發生、發展是多因素、多步驟進行性發展的復雜過程,包括癌基因的異常激活和抑癌基因失活等,原癌基因絲/蘇氨酸激酶Pim家族是目前研究的熱點。Pim家族有 3個成員 Pim-1、Pim-2和 Pim-3,能使在細胞生長通路中起關鍵作用的蛋白質分子內的絲/蘇氨酸殘基磷酸化,從而分別在細胞增殖、分化、凋亡中發揮著重要的調控作用〔5〕,其中人類Pim-3基因定位于染色體 22q13,其 cDNA由 2 392 bp組成,編碼包含了 326個氨基酸序列的開放讀碼框,Li等〔3〕發現Pim-3 mRNA在人的心臟、骨骼肌、大腦、腎臟、肺和外周血白細胞中存在,在心肌和骨骼肌中呈高表達,相反,在結腸、胸腺、肝臟和小腸的正常組織中不表達;同時還發現 Pim-3蛋白在人肝細胞癌的癌旁組織、癌組織中表達,且在癌組織中的表達要較癌旁組織高。另有研究也表明 Pim-3在肝癌、胰腺癌、結腸癌中有異常表達增加。這和在食管癌當中的研究一致。目前的研究主要認為 Pim-3通過以下途徑發揮生物學作用:①通過調控bcl-2家族的抗凋亡蛋白或抑制凋亡基因 bad和 Gfi-1,從而抑制細胞凋亡;②使酪氨酸磷酸酶(PTU-U2S)磷酸化,抑制磷酸酶的活性,從而阻止細胞凋亡;③激活細胞周期素 25A(CDC25A),促進細胞的 G1期進程,或抑制 C-轉化生長因子激酶 1(C-TAK1)的活性,促進 G2/M轉換;④激活信號傳導與轉錄激活因子(STAT-3)信號途徑,促進 G1/S的進程〔6〕。

本研究中患者的病理分級、臨床 TNM分期、侵襲深度、淋巴結轉移與否作為重要因素影響患者預后的結果與以往的研究結果相符。為了有效地控制混雜因素的影響,避免多因素的交互作用,從而顯示其獨立性,本文采用Cox回歸多因素模型分析發現:腫瘤病理分級、TNM分期、Pim-3表達是獨立的預后因素,其中病理分級、Pim-3表達最為重要,且病理分級和 Pim-3是危險因素。

1 Manning G,Whyte DB,Martinez R,et al.The protein kinase complement of the human genome〔J〕.Science,2006;298(5600):1912-34.

2 Fujii C,Nakamoto Y,Lu P,et al.Aberrant expression of serine/threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines〔J〕.Int J Cancer,2007;114(2):209-18.

3 Li YY,Popivanova BK,Nagai Y,et al.Pim-3,a proto-oncogene with serine/threonine kinase activity,is aberrantly expressed in human pancreatic cancer and phosphorylatesbad to block bad-mediated apoptosis in human pancreatic cancer cell lines〔J〕.Cancer Res,2006;66(13):6741-7.

4 Zheng HC,Tsuneyama K,Takahashi H,et al.Aberrant Pim-3 expression is involved in gastric adenoma-adenocarcinoma sequence and cancer progression〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2008;134(4):481-8.

5 Fox CJ,Hammerman PS,Thompson CB.The Pim kinase control rapamycin-resistant T cell survival and activation〔J〕.J Exp Med,2005;201(2):259-66.

6 Bachmann M,M?r?y T.The serine/threonine kinase Pim-1〔J〕.Int JBiochem Cell Biol,2005;37(4):726-30.