來源于角毛殼菌的木聚糖酶xyn24基因克隆及特性1)

王艷君 楊謙

(福建師范大學福清分校，福清，350300)(哈爾濱工業大學)

木聚糖是大量存在于植物體內的植物纖維，在自然界的儲量僅次于纖維素［1］。木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是催化降解木聚糖的一類糖基水解酶，它可將由β－1，4－木糖苷鍵組成的木聚糖降解成低聚糖或木糖。木聚糖酶在飼料工業、功能性食品、紡織業、廢水處理、生物燃料、造紙等方面具有廣闊的應用前景而備受關注。國內外對木聚糖酶進行了較多的研究，尤其是絲狀真菌可產生分泌到胞外的木聚糖酶，便于酶的分離純化，加之絲狀真菌的產酶水平高于細菌及酵母菌［2］，因此，對絲狀真菌尤其是木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)的研究較多。角毛殼菌(Chaetomium cupreum)是一種重要的生物防治真菌，其生防作用除產生毒素及抗生素外，還可以產生大量的細胞壁降解酶，許多木聚糖酶已從微生物中克隆得到，但在角毛殼菌中尚未見報道。本研究從角毛殼菌中克隆得到木聚糖酶基因(xyn24)，為研究該菌的生防機制及其生防能力的改造奠定基礎。利用生物信息學手段進行分析，為進一步表達、純化及大量制備重組xyn24蛋白及相關功能研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

角毛殼菌菌株為哈爾濱工業大學微生物實驗室保存;Ex－Taq DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內切酶、IPTG等為寶生物工程(大連)有限公司產品;引物由上海英俊生物技術有限公司合成;膠回收試劑盒購自上海華舜公司;其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶xyn24基因全長cDNA的獲得

角毛殼菌菌絲體培養:角毛殼菌孢子接入PD液體培養基中，在27℃、220 r/min條件下培養48 h。4 000 r/min離心10 min收集菌絲，液氮速凍后于冰箱中－80℃保存備用。

角毛殼菌木聚糖酶基因ESTs序列的獲得:哈爾濱工業大學生命科學與工程實驗室構建了角毛殼菌菌絲體時期的cDNA文庫，利用BlastX軟件對角毛殼菌菌絲體的3 066條ESTs序列進行相似性搜索［3］。從中獲得角毛殼菌木聚糖酶基因的EST序列，登錄號為DV547992。

1.2.2 木聚糖酶xyn24基因全長DNA的獲得

角毛殼菌基因組的提取:采用改良的CTAB法［4］，取1.0 g的菌絲于液氮中研成粉末后，加600 μL預熱的2×CTAB使之充分混勻，65℃水浴10 min，不時混勻;10 000 r/min離心，棄去上清，加600 μL預熱的2×CTAB使之充分混勻，65℃水浴10 min，不時混勻;加等體積氯仿/異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)進行抽提，緩慢顛倒混勻10 min，10 000 r/min下高速離心10 min，上清轉入新的離心管中，棄去沉淀(重復2～3次);上清液加入等體積的異丙醇，于室溫沉淀DNA 15 min，10 000 r/min離心10 min，棄去上清;75%乙醇洗滌沉淀2次;加入適量TE，65℃溶解10 min;純化后的角毛殼菌菌絲基因組DNA于－20℃保存備用。

角毛殼菌木聚糖酶基因的擴增:以角毛殼菌基因組為模板，PCR擴增xyn24基因的DNA序列所使用的引物為:上游引物，5'－GACGATGGTCTCCTTCAAGGCTCT－3';下游引物，5'－CGGTTAGACAGTGATGCTGGAAGAAC－3'在上下游引物中分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，(加框處為酶切位點)。擴增程序為94℃、5 min;94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s，35個循環;72℃、7 min。PCR產物回收純化，與pMD18－T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上。用IPTG和X－gal進行藍白斑選擇，從白色菌落(氨芐抗性轉化子)提取質粒并酶切鑒定，將陽性克隆命名為pMD－T/Xyn，送上海博亞公司測序。

1.2.3 序列分析

用ORF軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找開放讀碼框;Pfam(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)進行蛋白家族預測以及用ProtParam軟件(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)計算蛋白的相對分子質量及等電點。

用BlastP進行相似性搜索，選擇了11條與角毛殼菌xyn24基因氨基酸序列相似性高的真菌木聚糖酶氨基酸序列;用MEGA4.0軟件對上述12種真菌的木聚糖酶基因的氨基酸序列進行多序列比對，構建進化樹;BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列同源性搜索;BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行保守區預測;Prosite(http://www.expasy.org/cgi－bin/prosite)分析蛋白質結構域。SignalP 3.0 Server(ExPASy Proteomics tools)進行信號肽預測。

2 結果與分析

2.1 角毛殼菌xyn24基因全長DNA及cDNA序列的獲得

提取角毛殼菌基因組作為模板，PCR擴增后的產物片段如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送交上海博亞公司測序。獲得全長DNA序列，并提交GenBank注冊，登錄號為EF026977。

圖1 xyn24基因的PCR擴增結果

2.2 角毛殼菌xyn24基因核苷酸序列分析

開放讀碼框由起始密碼子ATG至終止密碼子TAA(圖2)，共有690個堿基組成，編碼229個氨基酸，由1個內含子和2個外顯子組成，cDNA登錄號為DQ886937，DNA登錄號為EF026978。ProtParam分析表明該蛋白質的相對分子質量為24700，理論等電點為7.83，分子式為C1105H1620N306O340S3，不穩定系數為17.47，屬于穩定的蛋白質。

圖2 xyn24的ORF序列及推斷的氨基酸序列

2.3 角毛殼菌xyn24基因進化樹結構

xyn24基因推斷的蛋白質序列與其相似性較高的11種真菌木聚糖酶蛋白質序列進行BlastP比對，結果表明，角毛殼菌xyn24基因推斷的氨基酸序列與嗜熱革節孢菌(Scytalidium thermophilum AB114442)、細麗毛殼菌(Chaetomium gracile D49850)、柰恩端梗霉(Acrophialophora nainiana DQ641721)、球毛殼菌(Chaetomium globosum XM001221294)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa XM959052)、嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum AJ508932)、費希爾曲霉(Neosartorya fischeri XM001258637)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans XM656125)、土曲霉(Aspergillus terreus XM001216082)、禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus AJ004802)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica AJ548879)木聚糖酶基因序列相似性分別為78%、75%、74%、72%、72%、66%、64%、64%、64%、63%、61%。采用鄰接法分析12種真菌的木聚糖酶蛋白的進化順序，結果如圖3所示，xyn24蛋白與來源于嗜熱革節孢菌的的木聚糖酶處在同一組中，兩者的親緣關系最近，與球毛殼菌、嗜熱毛殼菌、細麗毛殼菌的親緣關系相對較近。

2.4 角毛殼菌xyn24蛋白結構域及合成后的化學修飾位點預測

通過BlastP進行保守區預測(圖4)，該木聚糖酶基因屬于糖基水解酶11家族，具有糖基水解酶家族11的保守區結構域，預測結果表明，糖基水解酶家族11結構域上具有2個活性位點，分別在第123～133位及第214～225位的氨基酸位置上。分析表明，該木聚糖酶蛋白共有N－豆蔻酰化位點10個;蛋白激酶C磷酸化位點4個;N－糖基化位點2個。表1列出了各位點在229個氨基酸序列中的位置及氨基酸組成。

2.5 角毛殼菌xyn24蛋白信號肽預測

木聚糖酶大多是胞外酶，都具有信號肽序列，經SignalP 3.0－NN預測結果(圖5)表明，xyn24在16(A)～17(L)位為信號肽切割位點。比較其他11種不同來源的同源性較高的木聚糖酶蛋白的信號肽切割位點見表2所示，經選擇12種不同真菌的木聚糖酶蛋白的信號肽切割位點符合下列通式:AX1A～X2P(其中X1為L，A，F;X2為L，F，A，M，S，T出現的頻率較高)。

圖3 12種真菌木聚糖酶蛋白進化樹

圖4 木聚糖酶xyn24保守區預測結果

圖5 角毛殼菌xyn24信號肽預測

表1 木聚糖酶xyn24合成后的化學修飾位點

表2 不同來源的真菌木聚糖酶基因的信號肽序列

2.6 角毛殼菌xyn24蛋白三級結構預測

通過SWISS－MODEL(http://swissmodel.expasy.org/repository/)對其三級結構進行預測，結果如圖6所示，xyn24含有一個α－螺旋并在外側，β折疊扭曲成一個空穴，可作為酶作用的活性位點。這種單一的β折疊結構符合糖基水解酶家族11的結構特征。

圖6 預測木聚糖酶xyn24三級結構

3 結論與討論

角毛殼菌基因組的提取過程中，真菌細胞壁的破碎是不可忽視的一個重要環節，本研究采用液氮研磨的方法，快速、低溫、研磨充分，高質量的基因組模板提高了后續實驗成功的可能性。

木聚糖酶根據其催化區氨基酸序列的組成不同，可分為糖基水解酶10和11家族［5］，此外還有一些木聚糖酶屬于第5、7、8、43糖基水解酶家族。糖基水解酶10家族的木聚糖酶的催化區是圓柱型(β/α)8結構［6］，而糖基水解酶11家族的催化區結構是2個反相平行的β片狀褶折和一個α螺旋組成，僅含有唯一的α－螺旋并在外側［7］，本研究克隆得到的xyn24具有糖基水解酶11家族催化區結構域的明顯結構特征。

xyn24基因具有一個很強的信號肽區，含有信號肽的蛋白質一般能夠被分泌到細胞外，可能作為重要的細胞因子起作用，從而具有潛在的應用價值。從本研究克隆得到的木聚糖酶基因xyn24及其相似性比對結果發現，其信號肽切割位點處的氨基酸A－A－P是進行信號肽識別和切割的關鍵部位。

蛋白質生物合成后活性調節的另外一種形式是化學修飾，包括蛋白質的糖基化和磷酸化。木聚糖酶的重要翻譯后加工位點是N－位和O－位糖基化。木聚糖酶蛋白經過糖基化修飾以后可以使整個酶蛋白在體內避免蛋白水解酶的作用，保持其穩定性，對于正常發揮木聚糖酶的功能具有重要作用。磷酸化是蛋白質合成后廣泛存在的一種化學修飾，是控制酶活性的重要步驟。許多情況下，磷酸化的蛋白質其酶活性大大提高;也有些情況下，磷酸化的蛋白質其酶活性下降甚至消失，從而對蛋白質的功能調節起重要作用。通過對xyn24蛋白的化學修飾位點的預測推斷，該蛋白的體外表達載體的選擇十分重要，如選擇比較優秀的巴斯德畢赤酵母表達系統，是木聚糖酶蛋白產物在體外具有酶活性的關鍵。因此，通過生物信息學的分析論證為后續實驗的成功奠定基礎。

［1］Prade R A.Xylanases:from biology to biotechnology［J］.Biotech Genet Eng Rev，1996，13:101－131.

［2］Polizeli M L T，Rizzatti A C S，Monti R，et al.Xylanase from fungi:properties and industrial applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，67(5):577－591.

［3］Zhang Haiyan，Yang Qian.Expressed sequence tags－based identification of genes in the biocontrol agent Chaetomium cupreum［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74:650－658.

［4］薩姆布魯克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆實驗指南［M］.2版.金冬雁，黎孟楓，候云德，等，譯.北京:科學出版社，2002:880－887.

［5］Henrissat B，Bairoch A.New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities［J］.Biochemical Journal，1993，293(3):781－788.

［6］Fujimoto Z，Kuno A，Kaneko S，et al.Crystal structure of Streptomyces olivaceoviridis E－86 β－xylanase containing xylan－binding domain［J］.Journal of Molecular Biology，2000，300(3):75－585.

［7］Kumar P R，Eswaramoorthy S，Vithayathil P J，et al.The tertiary structure at 1.59? resolution and the proposed amino acid sequence of a family-11 xylanase from the thermophilic fungus Paecilomyces varioti Bainier［J］.Journal of Molecular Biology，2000，295(3):581－593.