人參銹腐病拮抗放線菌的鑒定及發酵條件1)

姜云 陳長卿 王琳 馬貴龍

(吉林農業大學，長春，130118)

人參銹腐病(Cylindrocarpon destructans)是對人參根部危害最大的1種土傳病害，對人參產量和品質影響極大，常年發病率為24.9%～44.1%［1］，目前仍沒有較好的解決辦法，已成為人參連作的主要障礙。凡種過人參的土地，在幾十年內不能再植參，否則大部分乃至整個參根都會腐爛［2-3］。近年來，用化學防治措施來防治人參銹腐病的結果遠遠未達到人們預想的效果，而且過量使用化學農藥會破壞土壤的微生物環境，加重環境污染，也使得有毒物質在參根內大量積累，降低人參的商品價值，因此，人們把防治重點逐步轉向生物防治措施和農業防治措施上［4-5］。其中農用抗生素由于其具有無污染、不易使有害生物產生抗藥性等特點而成為重要的生物防治措施。農用抗生素來源于微生物，特別是放線菌［6］。目前從微生物中發現的大約8 000種生物活性物質中，近70%是由放線菌產生的［7］。本研究對采自吉林省人參主要種植區(集安市、通化市等)的土壤樣品進行了拮抗放線菌的篩選［8］，對優良菌株1a-3進行了鑒定并對其培養配方和發酵條件進行了研究，以便為抗生物質的分離提純提供試驗依據，為進一步的小試和中試生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑和儀器:試劑均為國產分析純;主要儀器為基恩士國際貿易有限公司的數碼顯微鏡(KEYENCE VHX-600)，太倉市實驗設備廠的恒溫振蕩培養箱(HZQX100)，德國KONTRON公司的高速冷凍離心機(T-42K)，上海精密科學儀器有限公司的酸度計(PHS-3C)，Ultra-Violet Products Ltd公司的自動凝膠圖像分析儀(GelDoc-It 200)。

菌株及保存:菌株1a-3按常規方法在高氏一號培養基上繁殖保存。

基礎發酵培養基(同種子培養基):每升含大豆粉20 g，葡萄糖10 g、NaCl 10 g、CaCO33 g、KH2PO41 g，pH值7.0。

1.2 菌株鑒定

形態學觀察:①采用插片法［9］將菌株1a-3劃線接種在高氏一號培養基上，同時將滅菌的蓋玻片(1 cm×1 cm)斜插入培養基內，28℃培養5 d后，取出蓋玻片在生物顯微鏡下觀察菌絲形態。②取在高氏一號平板上培養7 d的菌株1a-3進行掃描電鏡樣品加工處理。樣品用3%戊二醛室溫下固定4～6 h，后經系列丙酮脫水、CO2臨界點干燥、粘樣、鍍膜后在掃描電鏡下觀察菌絲和孢子形態。

培養特征和生理生化特征:參照《鏈霉菌鑒定手冊》［10］中推薦的部分培養基和方法進行，28℃培養12～15 d后觀察記錄特征。

細胞壁化學成分分析:采用快速薄板層析法［11-12］對菌株1a-3的細胞進行全細胞水解液氨基酸和糖型的分析。

分子鑒定:按照徐平的方法［13］提取菌株1a-3基因組DNA，采用通用引物［14］(F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3';R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')進行16 S rDNA的PCR擴增，經回收、連接和轉化后，在測序儀上進行測序，將所得序列與GenBank數據庫中序列進行BLAST分析比對，并選取相似性較高的菌株與菌株1a-3用MEGA4.0軟件構建系統進化樹。

1.3 菌株發酵培養及抑菌活性的測定

菌株發酵培養及發酵上清液的制備:發酵培養首先在種子培養基上28℃振蕩培養24 h(150 r/min)制成種子液;然后加3 mL種子液在基礎發酵培養基中(30 mL)，于28℃振蕩培養(200 r/min)72 h后，10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

混菌法測定發酵上清液的抑菌活性:將1 mL無菌水加入人參銹腐病菌的培養試管中，用接種針將菌絲和孢子刮下制成菌懸液與PDA培養基10 mL混合后到入9 cm的培養皿中制成平板，用直徑1 cm的打孔器在固體平板中打孔，然后向孔中加入發酵上清液200μL，25℃培養3d后測定抑菌圈大小。

1.4 發酵條件的研究

不同碳、氮源對發酵液抑菌活性的影響:在氮源質量濃度和其它培養條件不變的情況下［15］，分別用蔗糖、麥芽糖、甘油、正丁醇、玉米粉、淀粉等量替換基礎發酵培養基中的葡萄糖;在碳源質量濃度和其它培養條件不變的情況下，分別用酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等量替換基礎發酵培養基中的大豆粉，以基礎發酵培養基作對照，采用混菌法測定不同碳、氮源的發酵上清液對C.destructans抑菌活性的影響。

碳、氮源單因子試驗和正交試驗:在確定主要碳、氮源的基礎上，對大豆粉(0～22 g/L，按2 g/L遞增)、葡萄糖(0～6 g/L，按1 g/L遞增)、酵母粉(0～0.5 g/L，按0.1 g/L遞增)、玉米粉(0～18 g/L，以1.5 g/L遞增)進行單因子試驗，以確定其合適使用的質量濃度梯度。在此基礎上選擇L9(34)的正交試驗進行發酵抑菌試驗，因子水平見表1，發酵試驗重復3次，用混菌法測定抑菌活性，將3次的平均值作為試驗結果［16］，進行分析和統計后確定發酵配方。

表1 基于L9(34)的發酵抑菌試驗的因子水平

培養條件的摸索:在確定發酵培養基成分后測定不同培養條件下發酵液對C.destructans的抑菌活性，測定方法用混菌法，①種齡試驗。取30 mL種子培養基裝入250 mL三角瓶中，種子培養基成分同發酵培養基，用直徑10 mm的打孔器打取1塊1a-3菌碟接入種子培養基中，分別培養12、24、36、48、60、72 h后，以10%的接種量將其分別接種在發酵培養基中。②接種量試驗。在其它培養條件一致的條件下，將種子液分別以體積分數2%、4%、6%、8%和10%的水平接種到發酵培養基中，測定各搖瓶中發酵液的抑菌活性。③初始pH試驗。在其它培養條件一致的條件下，用酸度計將培養基的起始pH值(滅菌前pH值)分別調至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0搖床培養后，測定各搖瓶中發酵液的抑菌活性。④發酵溫度試驗。在其它培養條件一致的條件下，分別在24、28、32℃恒溫搖床培養，測量各搖瓶中發酵液的抑菌活性。⑤發酵時間試驗。在其它培養條件一致的條件下，發酵分別培養12～120 h(12 h遞增)，測定各搖瓶中發酵液的抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態學觀察

通過光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察發現，菌株1a-3的孢子絲呈寬大頂端螺旋形，帶有長柄，孢子柱形，表面光滑，常在氣生菌絲上形成長孢子鏈(圖1)。

圖1 菌株1a-3的菌絲和孢子形態

2.1.2 培養特征和生理生化特征

菌株1a-3在不同培養基上的培養結果見表2，其中在高氏一號培養基上氣生菌絲呈銀鼠灰色，菌落有水珠，長勢飽滿，基內菌絲黃色，有可溶性色素產生。生理生化測定結果表明，菌株1a-3能使明膠液化，淀粉水解，牛奶凝固，產生H2S，但不能在纖維素上生長;耐鹽性結果表明，菌株1a-3只能忍受5 g/L以下的鹽脅迫，在7～25 g/L鹽脅迫培養基上不生長。

2.1.3 細胞壁化學成分

細胞壁化學成分分析顯示，菌株1a-3含LL-二氨基庚二酸和甘氨酸;無特征性糖，糖型C。因此其細胞壁化學組分屬于Ⅰ型，符合鏈霉菌(Streptomyces)的化學分類特性。

2.1.4 分子鑒定

菌株1a-3 16 S rDNA的PCR擴增得到了1條1 500 bp左右大小的條帶，將測序所得的1 525 bp DNA序列與NCBI數據庫Blast比對，登錄號為HM560727。與其同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬，選取8株模式菌株進行系統發育分析，用MEGA4.0構建系統進化樹(圖2)，可以看出菌株1a-3與S.griseochromogenes(AB184387)聚于同一分支中，其相似性達到99%。

2.2 發酵條件

不同碳、氮源對發酵液抑菌活性影響:在供試的6種碳源中(表3)，除了淀粉為碳源時不產生抑菌圈外，其它碳源的抑菌活性都低于葡萄糖(對照)，在發酵過程中常選用速效碳源和緩慢碳源混合作為碳源，結合應用成本考慮，選用葡萄糖與玉米粉復合使用，作為本試驗碳源。在供試的6種氮源中(表4)，以硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉為氮源時無抗菌物質產生，對無機氮源的利用不好，而有機氮源中以大豆粉為氮源時產素能力最強，當以酵母粉單獨作氮源時，抑菌效果雖然一般，但酵母粉有提供氮源又促進發酵的雙重作用，所以選擇大豆粉和酵母粉作為氮源。

表2 菌株1a-3的培養特征

圖2 菌株1a-3與相關菌株的系統發育樹(分支處的數值為支持強度值)

表3 不同碳源對菌株1a-3產素的影響

表4 不同氮源對菌株1a-3產素的影響

碳、氮源單因子試驗和正交試驗結果表明，大豆粉按2 g/L遞增(2～6 g/L)、酵母粉按0.1 g/L遞增(0.2～0.4 g/L)、葡萄糖按1 g/L遞增(0～2 g/L)、玉米粉按1.5 g/L遞增(0～3 g/L)比較合適，每個因子3個水平，能反映出趨勢的變化。在此基礎上進行了正交試驗，9次試驗的抑菌圈直徑依次為20、22、17、21、20、23、19、24、22 mm。極差分析結果(表5)表明:4因子對發酵液抑菌活性的影響大小依次為大豆粉、玉米粉、葡萄糖、酵母粉。最佳碳氮源發酵配方為大豆粉2 g/L、酵母粉0.3 g/L、玉米粉3 g/L、葡萄糖1 g/L。

2.3 培養條件

在確定發酵培養基成分的條件下，對發酵培養條件進行了摸索，首先是將種子培養液培養24 h，以6%的接種量接入發酵培養基中培養;培養條件為:培養基的起始pH為7.0，恒溫搖床上28℃培養60 h，搖瓶裝量30 mL種子培養基于250 mL三角瓶中，轉速為200 r/min，發酵后，其抑菌活性最好，所以選擇此培養條件作為發酵培養條件。

表5 正交試驗極差分析結果mm

3 結論與討論

絕大多數抗生素產生菌為鏈霉菌屬，其次是諾卡氏菌屬(Nocardia)、游動放線菌屬(Actinoplanes)以及馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)等，其中鏈霉菌已成為放線菌中數量最多、而且產生抗生素種類也最多的一個屬。本研究在傳統分類原則的基礎上，通過分子生物學方法對目的生防菌株進行了分類鑒定。菌株1a-3在形態特征、培養特征、生理生化特征和細胞壁成分上與已知的灰產色鏈霉菌相似，并且結合分子生物學鑒定結果，最后歸為灰產色鏈霉菌。目前尚不能確定該菌株是否為1新種，還需要與模式種進行生理生化性質比較，并進行DNA雜交，根據同源性作進一步分析。另外，該菌株是否可被看作是農用抗生素的一個新來源，還需要后續試驗的進一步驗證。

發酵是抗生素產業化的基礎，這是因為盡管抗生素產生菌的性能優良，但若缺乏合理的發酵工藝，也不能將其潛力充分發揮。抗生素發酵除受營養因素的限制以外，合適的發酵條件也是不可忽視的重要因素［17］。通過試驗確定菌株1a-3的合適搖瓶發酵配方和培養條件為:葡萄糖1 g/L、玉米粉3 g/L、大豆粉2 g/L、酵母粉0.3 g/L、KH2PO40.1 g/L、CaCO30.3 g/L、NaCl 0.1 g/L，起始pH值7.0、28℃搖瓶培養60 h，搖瓶裝量30 mL種子培養基于250 mL三角瓶中，轉速為200 r/min發酵后，其效果較好。此試驗在考慮為放大中試及大規模生產的發酵條件打基礎的同時，還要考慮到后續活性物質的分離、提純，因此，除了考慮成本還要看是否會產生過多的色素和離子。并且，發酵是一個復雜動態的生命過程，試驗只對發酵條件中一些主要影響因子進行了分析，為了使其得到充分的產業化，在后續的試驗中還將采用生化等方法對其代謝過程進行檢測和研究，以明確發酵培養基中各成分的利用情況與菌絲生長和發酵液活性之間的關系［18］，從而有目的地選擇培養基和發酵條件。參考文獻

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