木材形成的分子生物學研究1)——“多組學”在應力木系統(tǒng)中的應用

李堅 石江濤

(生物質(zhì)材料科學與技術(shù)教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

木材具有復雜的生物學特征，并最終展現(xiàn)出優(yōu)劣不易的表型與品質(zhì)。經(jīng)典的木材科學研究，主要集中在立木采伐后的加工利用方面，盡可能發(fā)揮木材的優(yōu)良特性并抑制其缺陷;但是，整個過程都可以看作是一種后天的補救措施，不論是物理還是化學的處理方法都將給能源和環(huán)境帶來不小的壓力。木材行業(yè)自身，應該在低碳經(jīng)濟及人類可持續(xù)發(fā)展的生產(chǎn)實際中發(fā)揮積極作用。選擇生物技術(shù)方法，可以從源頭上改良木材品質(zhì)，提高其在低碳經(jīng)濟中的效率。對于木材品質(zhì)性狀的生物技術(shù)改良，目前尚處于原始材料積累階段［1］。要真正實現(xiàn)對木材品質(zhì)進行遺傳調(diào)控，必須將傳統(tǒng)的木材科學研究方法與現(xiàn)代分子生物學方法相結(jié)合，把研究對象從傳統(tǒng)的“死”的木材轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩摹盎睢绷⒛旧蟻?重在考察林木群體性狀的遺傳變異，挖掘木質(zhì)部發(fā)育中的關(guān)鍵基因，探索木材形成的分子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，掌握木材形成的分子調(diào)控基礎，指導木材品質(zhì)的定向遺傳改良。

1 木材形成的生物學過程

木材形成過程，可以看作是發(fā)育生物學上的木質(zhì)部發(fā)生過程［2］。該過程是一個有機的、復雜的生物學過程，是樹木將空氣中的CO2和水在光能及葉綠素條件下轉(zhuǎn)化成碳水化合物，并通過各種代謝途徑，將每種成分組裝在一起而形成具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的天然高分子材料。木材形成，起源于維管形成層，依次經(jīng)過細胞分裂、細胞增大和伸長、次生壁形成、木質(zhì)化、程序性死亡和心材形成生命活動循環(huán)而生［3］。木材形成，是一系列復雜的遺傳和生理因素的交互作用的結(jié)果。木質(zhì)部發(fā)生過程中，各個不同階段在分子水平上，都是在特定的時空條件下將細胞內(nèi)的基因組群有序表達。所有的生命過程，都是由相應的一群基因編碼的程序所控制。同一植物體，每一個細胞，都擁有相同的遺傳基因。它們之所以能發(fā)育成結(jié)構(gòu)和功能各異的組織或器官，是由于某些基因得以表達，另一些基因受到抑制而沒有表達。而樹木生長產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)的木材組織，最終表現(xiàn)出多變的木材特征性質(zhì)。這種可塑性，有可能是由木材形成中特異基因或蛋白質(zhì)的差異表達引起的［4］。

探討處于不同生理、病理條件下的有機體之間的未知基因的差異表達，是研究生命本質(zhì)的有效途徑。應力木，是樹木中的非正常組織，表現(xiàn)在樹木橫切面上特殊偏心的偏寬部分。通常是指，外部環(huán)境或條件的改變誘導形成的彎曲或傾斜的樹干，試圖恢復原來垂直高生長或維持樹枝的自然角度方向，從而形成的在解剖(圖1)、化學組成及物理力學性質(zhì)明顯不同的木材［4-7］。闊葉樹材偏心橫切面的寬邊，位于傾斜樹干的上側(cè)或受拉一側(cè)，稱為應拉木;針葉樹材偏心橫切面的寬邊，位于傾斜樹干的下側(cè)或受壓一側(cè)，稱為應壓木［8］。針葉材和闊葉材在次生木質(zhì)部結(jié)構(gòu)和性質(zhì)存在很多差異，所以要對兩類木材形成途徑進行同步研究。楊屬和桉屬作為闊葉樹基因改良研究的模式樹種［9-10］，而松屬為針葉樹的模式樹種［11］。相對于闊葉樹，針葉樹有較大的基因組堿基數(shù)(10～40 Gb)和較長的生長周期，這些因素限制了其分子遺傳分析和育種發(fā)展［12］。又由于裸子植物和被子植物進化距離較遠，阻礙了兩種基因資源的比對和共享。應力木系統(tǒng)，不僅是研究木材構(gòu)造與性質(zhì)關(guān)系、細胞壁化學組成和構(gòu)建、木材性質(zhì)與培育及加工利用關(guān)系的最佳實驗材料，同時也是研究木質(zhì)部發(fā)育形成的最佳實驗系統(tǒng)。

2 分子生物學基礎知識

細胞是構(gòu)成所有生命體的基本單元。植物的生活細胞有細胞壁、細胞質(zhì)和細胞核組成。細胞核包含了主要的染色體，攜帶著植物發(fā)育和生長所必需的遺傳信息。染色體是成對存在的，稱為同源染色體對。同一種物種正常個體中正常同類型細胞都具有相同數(shù)目的染色體數(shù)。如:花旗松有13對，26條;杉木有11對，22條［13］。染色體上的遺傳物質(zhì)是DNA，它是由堿基，脫氧核糖和磷酸組成。帶有遺傳信息的DNA片段稱為基因，是遺傳的基本功能單位。遺傳信息包含在DNA序列繪制的“天書”里，它又是如何被生命體讀懂，并和外界環(huán)境相協(xié)調(diào)的呢?基因?qū)⑦z傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。遺傳物質(zhì)在DNA和RNA之間可以可逆的傳遞，但是只能從RNA單向傳遞給蛋白質(zhì)。這就是所有具有細胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的中心法則。它是現(xiàn)代生物學中最重要的基本規(guī)律之一，在探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)及普遍規(guī)律方面起著巨大的作用［14］。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。它是與生命及各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)，它幾乎參與了所有的生命活動和反應。蛋白質(zhì)是一種復雜的有機化合物，其組成的基本單元是氨基酸。氨基酸序列完全是由細胞核內(nèi)對應基因編碼的。雙鏈DNA分子將存貯的遺傳信息轉(zhuǎn)錄成信使核糖核酸(mRNA)，后者移動并透過核膜，到達細胞質(zhì)中的核糖體，在轉(zhuǎn)運核糖核酸(tRNA)調(diào)控下翻譯轉(zhuǎn)錄的遺傳信息合成蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)鏈的生成經(jīng)過起始、延伸和終止，在每個階段都有特定的三聯(lián)密碼子。比如:AUG是起始密碼子，UAG、UAA、UGA是終止密碼子。總之，細胞核內(nèi)的DNA序列是遺傳信息的貯存載體，其嚴格遵循半保留復制法則和中心法則，將遺傳信息轉(zhuǎn)錄翻譯，最終產(chǎn)生形態(tài)迥異的萬千物種。

圖1 木材次生壁的多層結(jié)構(gòu)(楊木正常木(A、B)與應拉木(C、D)纖維不同壁層掃描電鏡圖和示意圖)

3 木材形成的“多組學”技術(shù)

分子生物學的總體目標是確定基因及其產(chǎn)物的功能，并將它們與代謝途徑和調(diào)控網(wǎng)絡聯(lián)系起來，深入認識生物系統(tǒng)的運行機制。隨著高通量、大規(guī)模的信息技術(shù)發(fā)展，在整體水平上研究生物系統(tǒng)成為可能。首先是對重要生物的全基因組測序、基因圖譜繪制;接下來就要確定這些基因在生物系統(tǒng)中的具體功能及相互作用。這就要通過轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及代謝組水平研究來實現(xiàn)。基因組是一個靜態(tài)的信息源，一般情況不因細胞類型和環(huán)境條件的變化而發(fā)生波動;而轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及代謝組水平物質(zhì)是動態(tài)的，相對豐度隨著生境條件和自身生理條件的變化而波動。將不同組學研究聯(lián)系起來即成為“多組學”技術(shù)。通過該技術(shù)闡述每個基因的功能，以及基因彼此之間的協(xié)調(diào)作用網(wǎng)絡，才不至于將辛苦得來的基因組數(shù)據(jù)當做“天書”。就像木材發(fā)育一樣，我們不僅要了解每個組分的組成和作用，還要深入掌握組分之間相互協(xié)調(diào)的網(wǎng)絡作用，只有這樣我們才能真正意義上認知木材形成的生命過程。

3.1 基因組學研究

基因組學，從生物體所有遺傳信息著手，從整體水平上測定全部核酸、蛋白質(zhì)、糖類等生物分子復合體的一級結(jié)構(gòu)，計算或模擬其空間結(jié)構(gòu)，并在細胞中定位，以便確定在各種生物代謝途徑、生理途徑、信號傳導中系統(tǒng)水平上的分子結(jié)構(gòu)圖，從而在整體水平上理解生命的本質(zhì)。樹木基因組學研究最初是采用表達序列簽(EST)測序技術(shù)，探索松樹和楊樹木材形成過程中基因表達情況［11，15］;從此以后，開展了大量不同組織和樹種的EST研究。從標準化的桉樹全長次生木質(zhì)部cDNA文庫和幼齡材與成熟材的差減文庫克隆得到10 000個高質(zhì)量的ESTs［16］。通過從楊樹木質(zhì)部組織的cDNA文庫中大量獲取序列表達簽，對其進行基因作圖［17］，并可應用于重要材性性狀定位分析和圖譜克隆［18］。隨后，模式樹種楊樹的全基因組也測序成功［19］。應力木基因組研究已經(jīng)在火炬松和楊樹中展開，并獲得了大量表達序列簽。接下來要對基因在染色體上、細胞中定位、確定功能，還需要進行大量的功能驗證。

3.2 轉(zhuǎn)錄組學研究

轉(zhuǎn)錄組，是指在特定時空條件下，生物體將其所有編碼序列DNA分子的遺傳信息表達，產(chǎn)生的所有RNA分子。轉(zhuǎn)錄水平研究是基因功能驗證的重要手段之一，主要有以下幾種分析方法:基于微陣列技術(shù)(cDNA或oligonucleotides)、基于測序技術(shù)的基因表達系列分析(SAGE)、大規(guī)模平行信號測序(MPSS)、基于差異表達技術(shù)(DD-PCR)。

在林木中應用較多的是微陣列分析。應力木組織與正常木在基因表達水平上呈現(xiàn)差異。桉樹樹枝應拉木中阿拉伯半乳糖束狀蛋白編碼基因EgrFLA2表達差異最大，彎曲部位上部表達相對豐度是下部的27倍［20］。Paus等［10］通過玫瑰桉彎曲試驗，鑒定出一個纖維素合酶基因，并發(fā)現(xiàn)其在應拉木中表達豐度較高。許多參與木質(zhì)素生物合成的基因，在彎曲應拉木中的瞬時表達量增加，但在彎曲回復后又趨于正常。歐洲山楊×歐洲顫楊應拉木轉(zhuǎn)錄物分析發(fā)現(xiàn)，蔗糖合酶活性增加，因此促使更多的碳元素參與纖維素生物合成。但是，不同次生壁特異纖維素合酶基因，在表達水平上存在很大差異［21］。免疫化學實驗，也驗證美國楓香樹和樸樹應拉木中阿拉伯半乳糖束狀蛋白編碼基因表達豐度升高［22］。最近研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)壁層形成中有木葡聚糖內(nèi)源轉(zhuǎn)糖基酶(XET)表達，推測其可能參與木葡聚糖交聯(lián)結(jié)構(gòu)的修復［23］。

針葉樹種在轉(zhuǎn)錄水平上，針對不同表型木材形成的分子基礎做了大量研究［24-27］。Steven G Palph等［28］獲得阿拉斯加云杉200 000個ESTs和6464個高質(zhì)量的全長cDNA，為其建立了新的基因資源。裸子植物中參與細胞壁合成的基因，像3種MYB基因［29］、阿拉伯半乳糖蛋白編碼基因、α-和β-微管蛋白、木質(zhì)素合成相關(guān)基因等［24，30-31］，在應壓木中有相對較高的表達量。Yoshida M［32］采用熒光差異顯示技術(shù)，檢測日本扁柏應壓木形成中cDNA片段表達，在轉(zhuǎn)錄水平上的變化與木材材性變異的相關(guān)性。解剖結(jié)構(gòu)觀察表明，應壓木在樹木莖干基部比頂端區(qū)域形成更嚴重，顯示出應壓木形成與基因表達有相關(guān)性。差異表達基因，主要參與細胞分裂、細胞擴張和細胞壁加厚等生物學過程。Saori Yamashita等［33］研究應壓木形成程度與相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的關(guān)系。隨著彎曲角度增加，木質(zhì)素含量和一個與漆酶高度相似的轉(zhuǎn)錄物相對豐度增加;管胞長度隨彎曲角度增大而減小，同時一個與抗壞血酸鹽氧化酶高度相似的轉(zhuǎn)錄物相對豐度降低。木質(zhì)部發(fā)生是包含不同發(fā)育階段，不同細胞類型以及千變?nèi)f化基因表達的復雜生物學過程［34］。迄今為止，很難將不同發(fā)育時期，分解的極其準確并進行基因表達分析。也許，隨著單細胞技術(shù)的發(fā)展，將有可能對樹木形成層細胞分化的基因表達，進行更準確的闡述。

3.3 蛋白質(zhì)組學研究

蛋白質(zhì)組，是在一定條件下，由特定細胞或生物體產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)［35］。細胞通過調(diào)控其蛋白質(zhì)的表達水平和活性來適應內(nèi)外環(huán)境的改變，所以蛋白質(zhì)組無論是在質(zhì)或量上的改變，都反映了處于生活中的細胞的狀況。蛋白質(zhì)組，是一個復雜而動態(tài)的統(tǒng)一體，它是依據(jù)其組分的序列、結(jié)構(gòu)、豐度、定位、修飾、相互作用和生化功能來確定的。蛋白質(zhì)組學研究，也是首先從基本序列的認識開始，鑒定其組成和結(jié)構(gòu);依次是分析蛋白質(zhì)在不同生理狀態(tài)下的表達豐度，蛋白質(zhì)之間遺傳和物理的相互作用及其核酸或其它小分子間的相互作用;最后通過直接功能或蛋白質(zhì)芯片結(jié)合生物信息學技術(shù)，驗證確定蛋白質(zhì)功能。目前，常規(guī)蛋白質(zhì)組學的實驗流程和主要研究方法如圖2所示。

圖2 蛋白質(zhì)組學實驗流程及主要方法

應壓木與正常木木材形成過程中，蛋白質(zhì)表達豐度存在差異。蛋白質(zhì)表達水平，也影響木材的宏觀性質(zhì)。Plomion C.［30］利用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳首次分析應壓木應答蛋白，32個蛋白質(zhì)表達點與應力有關(guān)。1-環(huán)丙胺-1-羧酸氧化酶、咖啡-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和咖啡醇甲基轉(zhuǎn)移酶輔酶A表達上調(diào)。而后2種是木質(zhì)素合成途徑中的重要中間產(chǎn)物，這與應壓木中木質(zhì)素含量增加相吻合。海岸松木材形成組織蛋白質(zhì)組學研究［36］發(fā)現(xiàn)上千個蛋白質(zhì)點，分別經(jīng)過串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)和電離質(zhì)譜(MALDI-MS)分析部分蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其主要參與防御、碳水化合物和氨基酸代謝、基因和蛋白質(zhì)表達、細胞骨架、細胞壁生物合成以及新陳代謝。

木材形成組織非胞質(zhì)蛋白質(zhì)組分析，也可成為探索木材形成分子機制的強力工具。木質(zhì)部質(zhì)膜蛋白質(zhì)中，纖維素合酶和蔗糖合酶表達豐度較高，特有許多參與木質(zhì)素合成的酶類，可以推測，這些蛋白質(zhì)交聯(lián)成復合體并和質(zhì)膜有關(guān)聯(lián)［37］。Mast S.［38］等利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，分析輻射松應壓木形成組織細胞膜蛋白，鑒定175個蛋白點，大多數(shù)為細胞膜整合蛋白或發(fā)源于細胞成分(如細胞核、原質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和高爾基體)。經(jīng)生物信息學分析，預測大多數(shù)蛋白參與木材形成調(diào)控或細胞壁生物合成。

3.4 代謝組學研究

代謝水平分析，將成為功能基因組學和系統(tǒng)生物學的有力工具和重要組成部分。代謝組學，是對某一生物或細胞在特定生理時期內(nèi)所有低相對分子質(zhì)量量代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量分析的一門新學科［39］。代謝物質(zhì)是細胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物，它們的種類和數(shù)量變化被視為生物系統(tǒng)對基因或環(huán)境變化的最終響應［40］。代謝物質(zhì)成分復雜，物理化學性質(zhì)存在很大差異，需要通過多種分析手段才能獲得較完整的信息。目前應用的主要有:氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、核磁共振質(zhì)譜聯(lián)用(NMR-MS)。氣質(zhì)聯(lián)用可以同時檢測出數(shù)百種化合物，包括糖類、有機酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代謝物［41-42］。木材形成組織中，代謝物質(zhì)的變化是樹木對生長環(huán)境的應答。通過鑒定代謝物質(zhì)種類，描述代謝途徑，可以發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)控因子，解釋生物應答的分子機制。采用GC-MS技術(shù)分析火炬松幼齡材和應壓木木材形成組織中極性代謝物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)應壓木中果糖和葡萄糖相對表達豐度明顯低于正常木，而參與木質(zhì)素生物合成的重要中間產(chǎn)物:莽草酸、松柏苷含量增加［43］。這就可以在代謝水平上解釋應壓木中高木質(zhì)素、低纖維素含量的化學組成。紅松應壓木木材形成組織極性代謝產(chǎn)物中，果糖和葡萄糖含量也明顯降低。總體看，針對木材形成組織的代謝物質(zhì)分析研究相對較少。木材形成組織代謝水平研究還要對非極性部分分析，同時要對同一樣品進行多種方法分析，像結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用和核磁質(zhì)譜聯(lián)用3種或更多種平臺，這樣才能得到相對較完整、充分的認識。

3.5 生物信息學數(shù)據(jù)處理

生物信息學，是將生物遺傳物質(zhì)的化學信息轉(zhuǎn)變成計算機存儲的數(shù)字信息，為系列性、大規(guī)模研究與分析生命活動奠定基礎。基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組的生物信息，主要以數(shù)據(jù)庫的形式儲存。主要數(shù)據(jù)庫有:通用蛋白質(zhì)資源UniProt、美國的GenBank、歐洲的EBI和日本的DDBJ。還有一些實驗室，根據(jù)自己的實驗結(jié)果，建立的小型、單一物種的數(shù)據(jù)庫。木材形成組織相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，主要集中在這種類型。像桉樹ESTs數(shù)據(jù)庫［16］、楊樹轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫［44］、楊樹綜合功能基因組數(shù)據(jù)庫、云杉的ESTs和全長cDNA數(shù)據(jù)庫［28］等。隨著生物信息驟增，必須加強數(shù)據(jù)庫的管理和維護，提煉分支、清理冗余信息、增加資源共享度。生物信息，只有在生物體生命活動中才能真正體現(xiàn)它的功能，它又與生物體結(jié)構(gòu)相互依托。簡單將其信息化、孤立出來，其處理結(jié)果必然有局限性。期望從生命進化起源的視角，結(jié)合理性思維，來看待實驗結(jié)果。

4 結(jié)語與展望

研究現(xiàn)狀表明，通過生物技術(shù)，鑒定潛在參與木材形成和調(diào)控其化學組成與物理性質(zhì)的關(guān)鍵因子和候選基因，是科學的、有效的策略。應力木系統(tǒng)在該研究中具有不可替代的優(yōu)勢。大量理論證明，大多數(shù)植物的生物化學過程、細胞發(fā)育、新陳代謝及發(fā)生過程，都是相似的。因此，關(guān)于木質(zhì)部發(fā)生過程，也已在基因工程模式植物擬南芥(Arabidopsis)和百草目(Zinnia elegans)中展開研究［45-46］。采用“多組學”技術(shù)，在整體水平上研究木材形成的生物學過程，是必要的，也是必然的，將會更加全面和精確地闡述木材形成的生物學過程。從植物樣品的采集、實驗技術(shù)的運用、數(shù)據(jù)的分析、深層次生命信息的發(fā)掘，都是互相聯(lián)系、相輔相成的。木材形成中多組學實驗的開展，應該平行進行、橫向拓展，將所得信息聯(lián)系起來，不能使之孤立。

圖3 木材形成組織多組學分析流程

以后研究中應該注意的問題:①實驗材料多樣化，使得實驗方法凌亂，難以標準化。②取樣標準難以統(tǒng)一;如何科學縝密地獲取，需要專業(yè)的技術(shù)和豐富的經(jīng)驗。③實驗周期短、樣本少，難以提供完整、充分的驗證數(shù)據(jù);樹木生長生命周期較長，某一性狀的形成需要長時間的遺傳積累。④實驗室之間數(shù)據(jù)難以共享。對一種或多種材料的研究，是很多學者關(guān)注的，平行進行的;但由于材料取樣、技術(shù)方法、實驗設備以及實驗人員操作等條件的限制，致使所得結(jié)果之間無法相互交流。一旦出現(xiàn)斷層，那么這些結(jié)果將變得毫無意義。⑤多組學實驗數(shù)據(jù)之間的聯(lián)系、標準化。⑥分子水平與更高層次認識水平的結(jié)合。木材具有如此的細胞結(jié)構(gòu)體系，不僅僅是生物大分子在分子水平上活動的結(jié)果。只在分子水平上認識木材細胞壁各組分的發(fā)育形成，是遠遠不夠的;應該從發(fā)育進化的角度，去探索揭示木材形成的生命本質(zhì)和奧妙。

［1］王明庥.林木遺傳育種學［M］.北京:中國林業(yè)出版社，2001.

［2］崔克明.植物發(fā)育生物學［M］.北京:北京大學出版社，2007.

［3］Plomion C，Leprovost G，Stokes A.Wood formation in trees［J］.Plant Physiology，2001，127(4):1513-1523.

［4］Déjardin A，Laurans F，Arnaud D.Wood formation in angiosperms［J］.Comptes Rendus Biologies，2010，333(4):325-334.

［5］Timell T E.Studies on opposite wood in conifers part(Ⅰ):chemical composition［J］.Wood Science and Technology，1973，7(1):1-5.

［6］Timell T E.Studies on opposite wood in conifers part(Ⅱ):histology and ultrastructure［J］.Wood Science and Technology，1973，7(2):79-91.

［7］Timell T E.Studies on opposite wood in conifers part(Ⅲ):distribution of lignin［J］.Wood Science and Technology，1973，7(3):163-172.

［8］Du S，Yamamoto F.An overview of the biology of reaction wood formation［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2007，49(2):131-143.

［9］Sterky F，Bhalerao R R，Unneberg P，et al.A populus EST resource for plant functional genomics［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(38):13951-13956.

［10］Paux E，Carocha V，Marques C，et al.Transcript profiling of eucalyptus xylem genes during tension wood formation［J］.New Phytol，2005，167(1):89-100.

［11］Lev-Yadun S，Sederoff R.Pines as model gymnosperms to study evolution wood formation and perennial growth［J］.Journal of Plant Growth Regulation，2000，19(3):290-305.

［12］Allona I，Quinn M，Shoop E，et al.Analysis of xylem formation in pine by cDNA sequencing［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:9693-9698.

［13］李堅，欒樹杰.生物木材學［M］.哈爾濱:東北林業(yè)大學出版社，1993.

［14］朱玉賢，李毅，鄭曉峰.現(xiàn)代分子生物學［M］.3版.北京:高等教育出版社，2007.

［15］Sterky F，Regan S，Karlsson J，et al.Gene discovery in the woodforming tissues of poplar:analysis of 5692 expressed sequence tags［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:13330-13335.

［16］David Rengel，Hélène San Clemente，F(xiàn)lorence Servant，et al.A new genomic resource dedicated to wood formation in eucalyptus［J］.BMC Pant Biology，2009，9(1):1-14.

［17］Cervera M T，Storme V，Ivens B.Dense genetic linkage maps of three populus species(P.deltoids，P.nigra and P.trichocarpa)based on AFLP and microsatellite markers［J］.Genetics，2001，158(2):787-809.

［18］Frewen B E，Chen T H，Howe G T，et al.Quantitative trait loci and candidate gene mapping of bud set and bud flush in populus［J］.Genetics，2000，154(2):837-845.

［19］Tuskan G A，DiFazio S，Jansson S，et al.The genome of black cottonwood populus trichocarpa(Torr.＆Gray)［J］.Science，2006，313:1596-1604.

［20］Lafarguette F，Leplé J C，Déjardin A，et al.Poplar genes encoding faciclin-like arabinogalactan proteins are highly expressed in tension wood［J］.New Phytologist，2004，164(1):107-121.

［21］Andersson-Gunner。as S，Mellerowicz E J，Love J，et al.Biosynthesis of cellulose-enriched tension wood in Populus:global analysis of transcripts and metabolites identifies biochemical and developmental regulators in secondary wall biosynthesis［J］.Plant J，45:144-165.

［22］Andrew J Bowling，Kevin C Vaughn.Immunocytochemical characterization of tension wood:gelatinous fibers contain more than just cellulose［J］.American Journal of Botany，2008，95(6):655-663.

［23］Nobuyuki Nishikubo，Tatsuya Awano，Alicja Banasiak，et al.Xyloglucan endo-transglycosylase(XET)functions in gelatinous layers of tension wood fibers in poplar:a glimpse into the mechanism of the balancing act of trees［J］.Plant Cell Physiology，2007，48(6):843-855.

［24］Whetten R，Sun Y H，Zhang Y，et al.Functional genomics and cell wall biosynthesis in loblolly pine［J］.Plant Molecular Biology，2001，47(1/2):275-291.

［25］Gregoire Le Provost，Raúl Herrera，Jorge Ap Paiva，et al.A micromethod for high throughput RNA extraction of forest trees［J］.Biological Research，2007，40(3):291-297.

［26］Egertsdotter U，van ZyI L M，MacKay J，et al.Gene expression during formation of earlywood and latewood in loblolly pine:wxpression profiles of 350 genes［J］.Plant Biology，2004，6(6):654-663.

［27］Cato S，McMillan L，Donaldson L，et al.Wood formation from the base to the crown in Pinus radiate:gradients of tracheid wall thickness，wood density，radial growth rate and gene expression［J］.Plant Molecular Biology，2006，60(4):565-581.

［28］Steven G Ralph，Hye Jung E Chun，Natalia Kolosova，et al.A conifer genomics resource of 200000 spruce(Picea spp.)ESTs and 6464 high-quality，sequence-finished full-length cDNAs for Sitka spruce(Picea sitchensis)［J］.BMC Genomics，2008，9:484-501.

［29］Frank Bedon，Jacqueline Grima-Pettenati，John Mackay.Conifer R2R3-MYB transcription factors:sequence analyses and gene expression in wood-forming tissue of white spruce(Picea glauca)［J］.BMC Plant Biology，2007，7:17-34.

［30］Plomion C，Pionneau C，Brach J，et al.Compression wood-responsive proteins in developing xylem of maritime pine(Pinus pinaster Ait.)［J］.Plant Physiol，2000，123:959-969.

［31］Koutaniemi S，Warinowski T，Karkonen A，et al.Expression profiling of the lignin biosynthetic pathway in Norway spruce using EST sequencing and real-time RT-PCR［J］.Plant Molecular Biology，2007，65(3):311-328.

［32］Saori Yamashita，Masato Yoshida，Hiroyuki Yamamoto，et al.Screening genes that change expression during compression wood formation in Chamaecyparis obtuse［J］.Tree Physiology，2008，28(9):1331-1340.

［33］Yamashita S，Yoshida M，Yamamoto H.Relationship between development of compression wood and gene expression［J］.Plant Science，2009，176:729-735.

［34］Du J，Groover A.Transcriptional regulation of secondary growth and wood formation［J］.J Inter Plant Biol，2010，52(1):17-27.

［35］(英)Twyman R M.蛋白質(zhì)組學原理［M］.王恒樑，袁靜，劉先凱，等譯.北京:化學工業(yè)出版社，2007.

［36］Jean-Marc Gion，Céline Lalanne，Grégoire Le Provost，et al.The proteome of maritime pine wood formation tissue［J］.Proteomics，2005，5:3731-3751.

［37］Robert Nilsson，Katja Bernfur，Niklas Gustavsson，et al.Proteomics of plasma membranes from poplar trees reveals tissue distribution of transporters，receptors，and proteins in cell wall formation［J］.Molecular＆Cellular Proteomics，2010，9:368-387.

［38］Mast S，Peng L，Jordan T W，et al.Proteomic analysis of membrane preparations from developing Pinus radiate compression wood［J］.Tree Physiology，2010，30(11):1456-1468.

［39］Goodacre Royston.Metabolic profiling:pathways in discovery［J］.Drug Discovery Today，2004，9(6):260-261.

［40］Fiehn O.Metabolomics:the link between genotypes and phenotypes［J］.Plant Molecular Biology，2002，48(1/2):155-171.

［41］Taylor J，King R D，Altmann T，et al.Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine learning［J］.Bioinformatics，2002，18(2):241-248.

［42］Tolstikov V V，F(xiàn)iehn O.Analysis of highly polar compounds of plant origin:Combination of hydrophilic interaction chromatography and electrospray ion trap mass spectrometry［J］.Analytical Biochemistry，2002，301(2):298-307.

［43］Yeh T，Morris C，Goldfarb B，et al.Utilization of polar metabolite profiling in the comparison of juvenile wood and compression wood in loblolly pine(Pinus taeda)［J］.Tree Physiology，269(11):1497-1503.

［44］Zhu Q H，Guo A Y，Gao G，et al.DPTF:a database of poplar transcription factors［J］.Bioinformatics，2007，23(10):1307-1308.

［45］Chaffey N，Cholewa E，Regan S，et al.Secondary xylem development in Arabidopsis:a model for wood formation［J］.Physiologia Plantarum，2002，114(4):594-600.

［46］Reiter W D.Arabidopsis thaliana as a model system to study synthesis，structure，and function of the plant cell wall［J］.Plant Physiology and Biochemistry，1998，36(1/2):167-176.