臍帶間充質干細胞輸注治療頑固性潰瘍性結腸炎

劉 靜 韓冬梅 薛 梅 朱 玲 王志東 閆洪敏 郭子寬 王恒湘

臍帶間充質干細胞輸注治療頑固性潰瘍性結腸炎

劉 靜 韓冬梅 薛 梅 朱 玲 王志東 閆洪敏 郭子寬 王恒湘

目的 探討臍帶間充質干細胞輸注治療頑固性潰瘍性結腸炎的療效。方法 對1例頑固性潰瘍性結腸炎患者采用臍帶來源的間充質干細胞靜脈輸注，每周1次，劑量為（1．5～1．8）×106cells/Kg，4周為一個療程，共兩個療程。流式細胞儀分別檢測治療前后外周血免疫細胞的比例變化。結果 兩個療程后，患者腹痛及頑固性腹瀉消失，外周血中CD4＋/CD8＋細胞比例略有增加。結論 間充質干細胞輸注治療潰瘍性結腸炎是安全的，這種新型療法可能是治療頑固性潰瘍性結腸炎的一個合適選擇。

間充質干細胞 潰瘍性結腸炎 輸注

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一類反復發作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病。確切病因和發病機制尚不清楚，可能是遺傳易感者在環境因素和腸道菌群作用下，免疫和炎癥反應失調所致。氨基水楊酸類藥物、皮質激素、免疫抑制劑是目前治療潰瘍性結腸炎的主要方法，這些非特異性抗炎和免疫抑制藥物，只能暫時控制和緩解癥狀，不能從根本上治愈該病，且長期應用不良反應增多，停藥后易復發（1年復發率大于50%）。部分對激素產生耐藥性的頑固性患者效果更差，嚴重危害健康。間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSC）具有調節免疫、促進黏膜修復的功能[1]。我院率先采用臍帶間充質干細胞靜脈輸注治療1例頑固性UC患者，療效較好。

1 病例資料

患者，男，25歲，2007年6月開始，出現無明顯誘因的中上腹、左下腹隱痛不適，膿血便，2～3次/日，給予柳氮磺嘧啶，上述癥狀有所減輕。2008年7月，上述癥狀加重，頻繁膿血便，每日10余次，伴有劇烈腹痛，無發熱、惡心、嘔吐，再次就診，行腸鏡檢查示“全結腸黏膜彌漫性充血水腫，散在點片狀糜爛潰瘍”，診斷為潰瘍性結腸炎。給予5-氨基水楊酸、強的松等藥物治療，強的松最大量為60 mg/d，病情控制后減量至30 mg/d，但減量后病情反復。2009年3月，病情再次加重，癥狀同前，將強的松改為強的松龍，起始60 mg/d，癥狀控制后逐漸減至25 mg/d，但減量后病情亦反復。之后長期給予強的松龍25 mg/d、5-氨基水楊酸4 g/d、硫唑嘌呤100 mg/d。患者長期腹痛，大便3次/日，膿血便，體重下降。2009年3月，2009年8月和2010年1月，結腸鏡檢查均提示“潰瘍性結腸炎（全結腸）”。2010年1月入我院，查體：消瘦，精神差，中上腹及左下腹部壓痛，腸鳴音亢進，余未見異常。診斷：潰瘍性結腸炎（全結腸），活動期，中度，慢性持續型。

2 治療方法

2.1 臍帶間充質干細胞制備

按文獻方法稍加改良后進行臍帶間充質干細胞（Umbilical cord MSC，UC-MSC）制備[2]。即，經知情同意及感染源檢定后收集臍帶，去除外膜和動靜脈，將臍帶剪成0．5 cm3大小組織塊，加入等體積0．2%Ⅰ型膠原酶，37℃消化過夜。次日，加入兩倍體積的0．05%胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min離心10 min收集細胞，計活細胞數。將細胞懸浮于hMSC無血清培養基（杭州百威公司）中，按1×106cells/cm2的密度接種于塑料培養瓶中。1周后出現由數十個形態類似于成纖維細胞組成的集落。加入0．05%胰蛋白酶消化，按6 000 cells/cm2的密度接種細胞，并進行傳代培養。常規感染源檢定后，收集第3代細胞用于治療。

2.2 流式細胞儀細胞表型分析

收集 MSC，分別加入 PE標記的小鼠抗人PDGF-R、CD31、CD44、CD45和CD73單克隆抗體（BD公司，美國），室溫避光反應20 min后，PBS洗滌。在治療前及治療1周后采集患者外周血，分別加入 PE或 FITC標記的小鼠抗人 CD3、CD4、CD8、CD19、CD56以及Per-cep標記的CD45單克隆抗體，反應同前。BD Calibur（BD公司，美國）收集數據，WinMdi-2．9軟件分析結果。

2.3 細胞治療

采用靜脈輸注。首療程：UC-MSC 1．5×106cells/Kg每次（8×107個/次）；次療程：UC-MSC 1．8×106cells/Kg每次（1×108個/次）。每療程均治療4周，每周注射1次。

3 結果

3.1 UC-MSC的鑒定

收集MSC進行表型分析，細胞均一表達CD73（間充質細胞標記）、黏附分子CD44，不表達內皮細胞標記CD31和白細胞標記CD45，符合MSC表型特征。三次細胞表型分析獲得近似結果（圖1）。

圖1 臍帶MSC表型特征Fig.1 The expression of CD31,CD44,CD45,CD73 in UC-MSCs

3.2 MSC治療效果觀察

2010年1月21日至2月11日，給予UC-MSC治療1療程，第一次輸注1周后患者腹痛減輕，大便次數減為2次/日，膿血便明顯減少；經首療程治療，患者精神、食欲恢復正常，腹痛及腸鳴音亢進消失，大便帶有少許膿血，1～2次/日。維持2個月后，腹瀉頻率增加，腹痛再次出現，膿血便4次/日。4月22日開始應用腫瘤壞死因子單抗治療 （隔周注射1次）。5月中旬大便次數減為2～3次/日，有少許膿血。6月大便為黃色成形軟便，1～2次/日。7月開始出現膿血便，逐漸加重，最多10次/日。停用腫瘤壞死因子單抗，強的松龍增為60 mg/d，繼續口服5-氨基水楊酸、硫唑嘌呤、整腸生、固腸止瀉丸，治療3月效果欠佳，膿血便8～10次/日，伴腹痛。2010年10月14日至11月4日，接受UC-MSC治療1療程，第一次治療后腹瀉次數減少為5次/日，腹痛較前明顯減輕，為腹部隱痛，食欲改善。第二次治療后腹瀉次數進一步減少，2～3次/日，膿血便減少，腹痛較前減輕，強的松龍由60 mg/d逐漸減至50 mg/d。第三次治療后腹瀉消失。第四次治療后，大便1～2次/日，黃色成形便，便常規潛血陰性。停止治療1個月后，強的松龍減至30 mg/d，無明顯不適主訴，大便正常，體重由該次治療前的57 Kg增為60 Kg。治療期間及治療后無發熱等任何不良反應記錄。

3.3 病人外周血免疫細胞比例的改變

治療前免疫細胞比例監測：CD3陽性細胞比例為83．1%，CD4為40．7%，CD8為38．2%，CD19（B淋巴細胞）為10．3%，CD56（NK細胞）為1．5%，Th/Ts= 1．07。治療后檢測：CD3陽性細胞比例為90．4%，CD4為 51．3%，CD8為 37．6%，CD19（B淋巴細胞）為8．7%，CD56（NK細胞）為0．45%，Th/Ts=1．39，較治療前略有升高。

4 討論

UC是一種局限于結腸黏膜及黏膜下層的炎癥過程，以結腸黏膜彌漫性損害（炎癥、糜爛、潰瘍等）為特點，主要癥狀有腹瀉、膿血便、腹痛和里急后重，病程漫長，常反復發作。本病可見于任何年齡，20～30歲最多見。其發生可能與現代生活方式、基因遺傳、腸道菌群的免疫耐受缺失、免疫反應激活等因素有關。目前的治療在于控制活動性炎癥和調節免疫紊亂，包括抗炎藥物、激素、免疫抑制劑、生物治療等多種治療手段，但無一具有長期療效且副作用頗多。頑固性UC指誘導或維持緩解治療失敗，通常為皮質激素抵抗或依賴的病例。這些激素依賴或者抵抗的頑固性UC，病程遷延，局部和全身并發癥增多，重度UC死亡率仍較高，嚴重危害患者的健康，尋找有效的治療方法成為臨床研究的難點和重點。

MSC是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，來源廣泛，易于獲取，在適宜環境中能夠分化為內、中、外胚層或神經外胚層的細胞。一些研究顯示MSC擁有歸巢到損傷組織的能力，這與損傷部位炎性因子釋放增多，而MSCs表達某些炎性因子受體有關[1－2]。MSC在損傷部位通過分化為損傷細胞類型，分泌適當的細胞因子和生長因子來參與組織的修復[3]。另外，MSC在體內及體外擁有獨特的抑制免疫反應的作用[3]，通過細胞間的接觸以及分泌可溶性抗炎因子，如腫瘤壞死因子拮抗劑等而發揮作用，可抑制T、B淋巴細胞的活化，降低樹突狀細胞抗原遞呈作用及其功能，從而可能調節腸道的炎性反應[4]。動物實驗表明，將異基因鼠骨髓MSCs靜脈輸注給UC大鼠，MSC多歸巢于結腸病變部位，通過直接向腸系分化而使組織再生，并且在結腸部位炎性介質如TNF-α、IL-1β和環氧合酶-2（COX-2）明顯減少，而生長因子b-FGF、HGF、VEGF明顯升高，通過抗炎及促修復雙重作用達到治療目的，使大鼠便血減輕，體重增加[5]。臨床上，MSC已用于治療除UC外的另外兩種炎性腸病，即克隆氏病及腸道移植物抗宿主病，均已進入Ⅱ期或Ⅲ期臨床試驗。國外有文獻報道，將自體MSC局部注射入克隆氏病患者的9個瘺管中，8周后75%的瘺管愈合[6]。MSC治療激素耐藥的急性腸道移植物抗宿主病的Ⅱ期臨床研究顯示，55例患者接受HLA相合、半相合、完全不合供者的MSCs靜脈輸注，其中30例達到完全反應，9例有改善，無副作用發生，且有效率與HLA匹配無關[7]。截止目前，MSC對UC的治療尚未見報道。

人臍帶華爾通膠含有豐富的MSC，在體外可大量擴增，還可凍存，應用前復蘇，短時間內即可收獲足量的細胞用于臨床治療。Shetty等[8]比較骨髓、臍帶、臍血獲得的MSC，三種來源的MSC具有同樣的MSC表面分子表達：CD73＋、CD105＋、SSEA4＋、CD29＋、CD44＋和HLA ABC＋，而不表達與移植排斥相關的HLA DR，在體外長期培養過程中能保持其多向分化潛能。在混合淋巴細胞檢測中呈免疫抑制，抑制T細胞增殖，異體移植該細胞可產生免疫耐受性[9]，表明其為一類免疫原低下細胞，異基因移植不會發生免疫排斥反應。我們采用了臍帶來源的MSC治療。

本例患者診斷明確，發病時間3年，癥狀進行性加重而無特效治療措施。經靜脈注射MSC治療，使患者腹痛、腹瀉、膿血便消失。本文采用MSC輸注治療頑固性UC的方法安全有效。對于維持治療還需要隨訪和擴大病例數，進行更為嚴重深入的研究。

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Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Infusion for the Treatment of Refractory Ulcerative Colitis

LIU Jing1,HAN

Dongmei1,XUE Mei1,ZHU Ling1,WANG Zhidong1,YAN Hongmin1,GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1.1 Department of Hematology,General Hospital of the Air Force,Beijing 100142,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute ofRadiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding author:WANG Hengxiang (E-mail: wanghengxiang123@yahoo.com.cn).

Objective To investigate the safety and effectiveness of umbilical cord mesenchymal stem cells infusion in the treatment of ulcerative colitis．Methods A patient with ulcerative colitis received two cycles of mesenchymal stem cell infusion at a dose of(1．5-1．8)×106cells/Kg once a week for 4 consecutive weeks．The phenotypic characteristics of peripheral blood immune cells were analyzed before and one week after the treatment by FCM．Results The patient's abdominal pain disappeared and diarrhea was completely controlled．The ratio of CD4＋/CD8＋cells was slightly elevated after cell infusions．Conclusion Mesenchymal stem cell infusion for the treatment of ulcerative colitis is safe and effective．The novel regimen described here might be a suitable choice for the treatment of refractory ulcerative colitis．

Mesenchymal stem cells;Ulcerative colitis;Infusion

Q813．1＋2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年7月8日；

2011年7月28日）

10．3969/j．issn．1673-0364．2011．05．001

首都發展基金重點項目（2007-2033），國家自然科學基金（30971068和30871018），軍隊臨床高新技術重大項目（2009）。

100142 北京市 北京空軍總醫院血液科 （劉靜，韓冬梅，薛梅，朱玲，王志東，閆洪敏，王恒湘）；100850 北京市 北京放射與輻射醫學研究所（郭子寬）。

王恒湘（E-mail：wanghengxiang123@yahoo．com．cn）。