酶聯免疫法測定土壤中莠去津

胡曉航，王皙瑋，吳玉梅，周 芹，許慶軒

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.農業部甜菜品質監督檢驗測試中心，哈爾濱150080；3.黑龍江大學農作物研究院，哈爾濱150080）

酶聯免疫法測定土壤中莠去津

胡曉航1,2,3，王皙瑋1,2,3，吳玉梅1,2,3，周 芹1,2,3，許慶軒1,2,3

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.農業部甜菜品質監督檢驗測試中心，哈爾濱150080；3.黑龍江大學農作物研究院，哈爾濱150080）

用定量酶聯免疫法對土壤中莠去津的殘留進行初篩，然后對陽性樣品用氣相色譜-質譜法進行確證，并對兩種方法的回收率、精密度及檢測限進行評價。向土壤樣品中分別添加0.3、1.0、3.0μg/kg濃度水平的莠去津標準品時，ELISA的平均回收率為92.20%～97.14%，變異系數為1.69%～4.11%，檢測限為0.04μg/kg；GC-MS的平均回收率為85.46%～87.68%，變異系數為2.93%～4.05%，檢測限為0.03μg/kg。對酶聯免疫試劑盒篩選的3個陽性樣品用GC-MS進行確證，測定結果基本一致，結果滿意。研究表明酶聯免疫法重復性好、準確度較高，是一種土壤中莠去津殘留的快速篩選方法。

土壤；莠去津；酶聯免疫法；氣相色譜-質譜法

莠去津是一種三嗪除草劑，又名阿特拉津，化學名稱為2-氯-4乙氨基-6-異丙氨基1，3，5三嗪，結構式見圖1。分子量為215.7，熔點為175～177℃，化學性質穩定[1]，作為除草劑，莠去津持效期長，對下茬敏感作物的殘留藥害問題影響大。近年來，莠去津在環境中的殘留不斷被檢測到，從而日益引起學術界和公眾對環境污染和防治的廣泛關注。目前，土壤中莠去津的殘留分析采用的分析方法主要是高效液相色譜-質譜、液相色譜/紫外檢測器、氣相色譜-質譜、氣相色譜/氮磷檢測器、氣相色譜/電子捕獲檢測器檢測[2-5]及酶聯免疫分析技術法[6]。酶聯免疫法作為一種篩選方法已經受到廣泛重視。本實驗運用酶聯免疫法和氣相色譜-質譜法對甜菜地中受莠去津殘留危害的土壤進行測定，并對兩種方法的回收率、精密度及檢測限進行評價。

1 材料與方法

1.1材料、試劑和儀器

1.1.1 樣品及其制備實驗所用受害土壤經風干研磨，粉末狀。

1.1.2 試劑莠去津標準品（純度≥99%，德國Dr ehrenstorfer），Atrazine ELISA(BRAXIS，Microtiter Plate)試劑盒（其中包括96微孔，6種濃度的Atrazine標準溶液，酶結合物，抗體，樣品稀釋液，顯色液TMB，終止液，檢測緩沖液，洗滌緩沖液），丙酮（Fisher色譜純），正己烷（色譜純），乙腈（Fisher色譜純），甲醇（DIKMA色譜純），NaCl（優級純）。

1.1.3 儀器Agilent 7890/5975-MSD氣相色譜-質譜聯用儀，配備CTC-PAL自動進樣器，Agilent 19091s-433毛細管柱（30m×250μm×0.25μm）；KQ-300DE型數控超聲波清洗器（產地昆山市）；凈化小柱Agela technologies Cleanert-Florisil-SPE(1000mg/6mL)；旋轉蒸發儀（英國RE300）；酶標分析儀（DNM-9602G北京普朗）；電腦洗板機（DNX-9620北京普朗）

1.2方法

1.2.1 樣品前處理方法(1)ELISA法在一個60mL的離心管中，稱取10g土壤樣品（去除水分），加入30樣品提取液（22.5 mL甲醇+7.5 mL水），劇烈震蕩混勻，低速離心3000r/min，30min，然后放置過夜。取1mL上清用樣品稀釋液50倍稀釋。(2)GC-MS法柱子活化，預先用5 m L正己烷+丙酮（9∶1）、5 mL正己烷淋洗Florisil-SPE萃取小柱，棄去淋洗液。稱取5g土樣，加入乙腈+水（5∶1）30 mL，超聲20min，轉移至裝有NaCl的具塞量筒中，劇烈震蕩，靜止15min，取乙腈層15mL，70℃旋蒸近干，用2mL正己烷溶解，轉移至Florisil-SPE萃取小柱，棄去淋出液，用5mL正己烷+丙酮（9∶1）淋洗萃取小柱兩次，收集兩次淋洗液，40℃旋蒸近干，加入1 mL正己烷定容，等待上機。

1.2.2 氣相色譜-質譜（GC-MS）儀器條件Agilent毛細管柱19091S-433（30m×0.25mm i.d.×0.25μm），柱初始溫度為60℃，保持1min，以15℃/min的速度升到250℃，保持4min不分流進樣，進樣量1μL，載氣為高純氦氣，流速1.1Ml/min，進樣口溫度為260℃，GC-MS接口溫度280℃，離子源溫度230度，EI電子能量70eV，溶劑延遲時間1.7min，定量離子200掃描方式為全離子掃描。

1.2.3 ELISA分析步驟將標準品和樣品所用的微孔條插入微孔架，記錄標準品和樣品的位置。用多道移液器在每個微孔中加入25μL檢測緩沖液，在對應的微孔中加入100μL標準品或樣品，再加入50μL酶結合物，在室溫下孵育30min。倒出孔中液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打3次以保證完全除去孔中液體，每個微孔至少加入250μL，1×洗滌緩沖液，再倒掉孔中液體，重復操作3次。在每個孔中加入100μL顯色劑，室溫孵育20min。加入50μL終止液，30min后以各自空白為空白，在450nm下讀取每個孔的吸光度值（OD）。

1.2.4 ELISA標準曲線的制作及樣品濃度計算將所獲得的標準品和樣品的吸光度按下式折算成百分比吸光度B/B0（%）：用Excel繪制出標準曲線，并計算出樣品中莠去津的濃度。

1.2.5 精密度和準確度向土壤樣品中添加0.3、1.0、3.0μg/kg3個濃度水平的莠去津標樣，每個濃度做5次平行，同時做3個空白樣。按照1.2.1的方法分別進行前處理，并用酶聯免疫法和氣相色譜-質譜法測定甜菜地土壤中莠去津的含量，計算回收率，變異系數(RSD%)。

2 結果與分析

2.1 莠去津的質譜圖莠去津標準品一級質譜圖見圖2，分子量215，定量離子200。

圖1 莠去津的結構式

圖2 莠去津的一級質譜圖

2.2標準曲線

2.2.1 ELISA標準曲線按照1.2.3步驟，分別測定濃度為0、0.05、0.1、0.25、1.0、2.5、5.0μg/L莠去津標準液的吸光度，采用Excel建立標準曲線如圖3

2.2.2 GC-MS標準曲線取0.1、0.2、0.5、1.0、3.0、5.0μg/L的莠去津標準液經GC-MS分析得出標準曲線如圖4。

圖3 ELISA標準曲線

圖4 GC-MS標準曲線

2.3精密度和準確度、檢測限

實驗的準確度以回收率表示，精密度以變異系數來表示，ELISA和GC-MS測定結果見表1。從表中可以看出，向土壤樣品中分別添加0.3、1.0、3.0μg/kg濃度水平的莠去津標準品時，ELISA的平均回收率為92.2%～97.14%，變異系數為1.69%～4.11%；GC-MS的平均回收率為85.46%～87.68%，變異系數為2.93%～4.05%。GC-MS中以標準曲線中最低濃度標準溶液的濃度(0.1μg/L)定量色譜圖的3倍信噪比計算檢測限為0.03μg/kg。ELISA同時測定6個“0”標準液的吸光度，從標準曲線上查出對應于吸光度的各濃度，按照95置信度計算檢測限為0.04μg/kg。

2.4酶聯免疫法和GC-MS法檢測陽性樣品的確證試驗對酶聯免疫試劑盒篩選的3個陽性樣品用GC-MS進行確證，測定結果與試劑和方法一致，結果滿意，見表。

表1 ELISA與GC-MS法測定結果及加標回收率

3 結論

本實驗采用酶聯免疫法和氣相色譜-質譜聯用法測定土壤中莠去津的殘留，進行加標回收率試驗，0.3μg/kg加標水平的回收率分別為92.20%和86.02%，變異系數分別為1.69%和3.96%，前者適用于土壤中莠去津殘留的篩選，后者適用于陽性樣品的確證和精確定量。

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[3]任晉，蔣可，徐曉白.土壤中莠去津及其降解產物的提取及高效液相色譜-質譜分析[J].色譜，2004，22(2)：147-150.

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Determ ination of Residual Herbicide Atrazine in Soilby ELISA

HUXiao-hang1,2,3,WANG Xi-wei1,2,3,WU Yu-mei1,2,3,ZHOUQin1,2,3,XUQing-xuan1,2,3
(1.Key Laboratory ofSugarbeetGenetic Breeding,HeilongjiangUniversity,Harbin 150080,China; 2.Center for theControlofSugarbeetQuality,Ministry ofAgriculture,P.R.ChinaHarbin 150080,China；3.Institute forCrop Research,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)

The residuesofherbicide Atrazinewere determined in the soil.The initialscreeningwas done by ELISA, and the positive sampleswere confirmed by GC-MS(gas chromatography-mass-spectrography),then to evaluate the recovery,accuracy and LOD(limitofdetection)of towmethods.0.3，1.0，3.0μg/kg Atrazine ofstandard substancewas added to samples of soil,mean recovery from the ELISAmethod was 92.2%-97.14%,relative standard deviation was 1.69%-4.11%,LOD was 0.04μg/kg;mean recovery from the GC-MSmethod was 85.46%-87.68%,relative standard deviation was 2.93%-4.05%,LOD was 0.03μg/kg.The determined result of the GC-MSmethod was basically consistentwith thatofELISAmethod.The resultsshowed that the ELISAmethod to determine Atrazineof soil is fast, accurateand repeatable.

soil;Atrazine;ELISA;GC-MS

S

A

1007-2624（2011）01-0028-03

2010-10-21

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項基金資助項目（0032010056）。

胡曉航(1980-)，女，助理研究員，主要從事甜菜及土壤品質及農藥殘留檢測技術研究。E-mail：hxhlmz@163.com

吳玉梅，研究員，E-mail：zjzxwym@163.com