荸薺稈枯病菌生物學(xué)特性研究

潘麗，朱志賢，呂茹婧，鄭露，黃俊斌

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430070）

荸薺稈枯病菌生物學(xué)特性研究

潘麗，朱志賢，呂茹婧，鄭露，黃俊斌

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430070）

為研究湖北地區(qū)荸薺稈枯病的發(fā)生規(guī)律，研究了其對(duì)不同理化環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件的需求。試驗(yàn)結(jié)果表明，荸薺稈枯病菌（Cylindrosporium eleocharidis）菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)溫度為5～35℃，最適溫度為25～30℃；病菌菌絲最適宜在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PDB）中生長(zhǎng)，最適宜在綠豆汁培養(yǎng)基（MBA）上產(chǎn)孢。pH值為4～10時(shí)，病菌菌絲均能生長(zhǎng)，pH值為6～7時(shí)最適宜其生長(zhǎng)；病菌能利用多種碳源和氮源，碳源以蔗糖和淀粉利用效果最好，氮源以酵母膏和蛋白胨利用效果最好；病菌菌絲的最低致死溫度為50℃水浴10 min，分生孢子最低致死溫度為55℃水浴10 min。

荸薺；稈枯?。惠┧j柱盤(pán)孢；生物學(xué)特性

2008-2010年，荸薺稈枯病在湖北團(tuán)風(fēng)縣方高坪鎮(zhèn)荸薺種植基地發(fā)生嚴(yán)重，使得荸薺減產(chǎn)率達(dá)20%以上，重病田甚至絕產(chǎn)絕收，嚴(yán)重影響了荸薺的產(chǎn)量和品質(zhì)，給薺農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為弄清湖北地區(qū)荸 薺稈枯病菌 （Cylindrosporium eleocharidis）對(duì)不同理化環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件的需求，筆者對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，以期為研究該病害的發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同培養(yǎng)基上荸薺稈枯病培養(yǎng)性狀的觀察及產(chǎn)孢量的測(cè)定

將荸薺稈枯病菌供試菌株TF2009-1（下同）分別接種到有PDA、PSA、OMA、OTA、CA、MBA、VA、CWA培養(yǎng)基的平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，10 d后觀察菌落的形態(tài)和顏色，并拍照。15 d后在菌落表面加入5 mL無(wú)菌水，用玻璃涂棒刮取表層菌絲，經(jīng)2層擦鏡紙過(guò)濾得到分生孢子懸浮液，將其分裝至2 mL離心管中，5 000 r/min離心1 min，離心后用接種槍將離心液吸至1個(gè)1.5 mL離心管中，定容至1 mL，然后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量分生孢子懸浮液濃度。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2 不同培養(yǎng)液對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響

將上述8種培養(yǎng)液（培養(yǎng)基配方中不加瓊脂）設(shè)為8個(gè)處理，每處理4個(gè)重復(fù)。量取100 mL培養(yǎng)液加至250 mL三角瓶中，每瓶接入1塊直徑為6 mm的在PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌落邊緣的菌絲塊，封口后置于25℃、180 r/min恒溫?fù)u床中光照培養(yǎng)，10 d后稱量菌絲干質(zhì)量。

1.3 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響

供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，用孔徑為6 mm的無(wú)菌打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊，移至新鮮的PDA平板中央。設(shè)置5，10，15，20，25，30，35，40℃共8個(gè)不同的溫度處理，將接好菌的培養(yǎng)皿封口后分別置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，每處理5個(gè)重復(fù)，10 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，比較不同溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

將5 mL無(wú)菌水滴在PDA平板上生長(zhǎng)15 d的菌落表面，用無(wú)菌玻璃涂棒刮取表面菌絲，經(jīng)2層擦鏡紙過(guò)濾得到分生孢子懸浮液，然后用2 mL離心管分裝，離心后去上清，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量懸浮液濃度，再加入無(wú)菌水將分生孢子懸浮液濃度調(diào)至105個(gè)/mL，然后用無(wú)菌玻璃涂棒將100 μL分生孢子懸浮液均勻涂布在2%的水瓊脂平板上，分別置于上述8個(gè)不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，每處理5個(gè)重復(fù)，24 h后統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)率。

1.4 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響

供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，用孔徑為6 mm的無(wú)菌打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊，移至新鮮的PDA平板中央，然后將平板置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。設(shè)置連續(xù)黑暗、12 h光暗交替和連續(xù)光照3個(gè)處理（光源為普通日光燈18 W、22 cm，下同），每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，10 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，比較不同光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

分生孢子懸浮液的制備同1.3。用無(wú)菌玻璃涂棒將100 μL分生孢子懸浮液均勻涂布在2%的水瓊脂平板上，設(shè)置連續(xù)黑暗、12 h光暗交替和連續(xù)光照3個(gè)處理，光照強(qiáng)度及培養(yǎng)溫度同上，24 h后統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)率（%）。

1.5 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值，pH值分別設(shè)置3，4，5，6，7，8，9，10，11。在不同pH值的平板上接種直徑為6 mm的新鮮菌絲塊，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，每處理4個(gè)重復(fù)，10 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.6 不同碳源和氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響

以 Czapek培養(yǎng)液（2.00 g KNO3，1.00 g KH2PO4，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4·7H2O，0.01 g FeSO4，30.0 g蔗糖，1 000 mL蒸餾水）為基礎(chǔ)培養(yǎng)液[1]。用含碳量相同的淀粉、D-甘露醇、D-半乳糖、葡萄糖、L-山梨醇、麥芽糖、檸檬酸、果糖、乳糖代替其中的30.0 g蔗糖，以不加碳源作對(duì)照，各處理4個(gè)重復(fù)。向250 mL的三角瓶中加入100 mL Czapek培養(yǎng)液，每瓶接入1個(gè)直徑為6 mm的新鮮菌絲塊，置于25℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中光照培養(yǎng)，10 d后稱量菌絲干質(zhì)量。

以Czapek培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液[1]，用含氮量相同的酵母膏、蛋白胨、甘氨酸、谷氨酸、硝酸銨、氯化銨、尿素和硝酸鈉代替其中的2.00 g硝酸鉀，以不加氮源作對(duì)照，每處理4個(gè)重復(fù)。病原菌培養(yǎng)及菌絲干質(zhì)量稱量方法同上。

1.7 菌絲體及分生孢子致死溫度測(cè)定

①菌絲致死溫度測(cè)定 用直徑為6 mm的無(wú)菌打孔器在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打取菌絲塊，將菌絲塊置于加有1 mL無(wú)菌水的2 mL無(wú)菌離心管中，分別在35，40，45，50，55，60℃水浴鍋中處理10 min后取出冷卻，每處理5個(gè)重復(fù)，將菌絲塊取出，置于PDA平板上于25℃光照培養(yǎng)，10 d后觀察其生長(zhǎng)情況。

②分生孢子致死溫度測(cè)定 分生孢子懸浮液的制備方法同1.3。將其濃度調(diào)至105個(gè)/mL，移取1 mL分生孢子懸浮液于1.5 mL的eppendorf管中，分別置于35，40，45，50，55，60℃的水浴鍋中處理10 min后取出冷卻。每處理5個(gè)重復(fù)，將各重復(fù)中的100 μL孢子懸浮液用無(wú)菌玻璃涂棒均勻涂布在2%的水瓊脂平板上，于25℃光照培養(yǎng)，24 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用DPS 3.01軟件分析光照條件、溫度、pH值、不同碳源和氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)及產(chǎn)孢量的影響，并用Tukey法比較不同處理間的差異顯著性（P=0.05）。用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)TF2009-1產(chǎn)孢量的影響

TF2009-1在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和培養(yǎng)性狀有差異，在OMB和CA上菌絲生長(zhǎng)較稀疏。由圖1可知，TF2009-1在各培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量有顯著性差異，在MBA上產(chǎn)孢量最高，為17.3×105個(gè)/mL，其次為CWA、OTA和CA，產(chǎn)孢量分別為7.7×105，4.3×105，4.0×105個(gè)/mL，在 OMA、VA、PSA和PDA上的產(chǎn)孢量最低，分別為2.4×105，2.2×105，2.1×105，1.6×105個(gè)/mL。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)TF2009-1產(chǎn)孢量的影響

2.2 不同培養(yǎng)液對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響

TF2009-1在不同培養(yǎng)液中的菌絲生物量存在顯著性差異。在PDB中菌絲生物量最高，為10.987 mg/mL，其后依次為 PSB、CWA、OTB、MBB、VB和CB，分別為9.517，7.093，6.150，4.360，3.770，3.572，3.190 mg/mL，在OMB中菌絲生物量最低，為3.190 mg/mL（圖2）。

圖2 不同培養(yǎng)液對(duì)TF2009-1菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)及分生孢子萌發(fā)的影響

菌絲在5～35℃的溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適宜生長(zhǎng)溫度為25～30℃，5，10，35℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制，40℃時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)（圖3）。

圖3 不同溫度對(duì)TF2009-1菌絲生長(zhǎng)的影響

分生孢子在5～35℃溫度范圍內(nèi)均能萌發(fā)，15～ 35℃較適宜萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)80.0%以上；25℃最適宜萌發(fā)，萌發(fā)率為93.3%；5℃時(shí)抑制孢子萌發(fā)，萌發(fā)率僅為24.0%；40℃時(shí)孢子不能萌發(fā)（圖4）。

圖4 不同溫度對(duì)TF2009-1分生孢子萌發(fā)的影響

2.4 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)及分生孢子萌發(fā)的影響

TF2009-1在PDA平板上連續(xù)光照、12 h光暗交替、連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)10 d后菌落平均直徑分別為7.04，7.28，7.20 cm，三者間無(wú)顯著性差異（圖5）。

圖5 不同光照對(duì)TF2009-1菌絲生長(zhǎng)的影響

分生孢子在連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照條件下培養(yǎng)24 h后，分生孢子萌發(fā)率分別為97.7%，97.8%，96.7%，三者間無(wú)顯著性差異（圖6）。

圖6 不同光照對(duì)TF2009-1分生孢子萌發(fā)的影響

2.5 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

TF2009-1在不同pH值的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，菌落平均直徑存在顯著性差異。培養(yǎng)基的pH值為3.0～ 10.0時(shí)，菌絲均能生長(zhǎng)；pH值為4.0～10.0時(shí)，菌落平均直徑大于6.0 cm，較適宜菌絲生長(zhǎng)；培養(yǎng)基pH值7.0時(shí)，病原菌生長(zhǎng)最快，菌落平均直徑為8.03 cm；pH值3.0時(shí)，菌落生長(zhǎng)最慢，菌落平均直徑為5.36 cm；培養(yǎng)基pH值為4.0，5.0，6.0，8.0，9.0和10.0時(shí)，菌落平均直徑分別為6.65，6.83，7.55，7.38，6.54，6.09 cm； pH值為11.0時(shí)，菌絲不能生長(zhǎng)（圖7）。

圖7 不同pH值對(duì)TF2009-1菌絲生長(zhǎng)的影響

2.6 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

TF2009-1在供試的10種不同碳源培養(yǎng)液和不加碳源（CK）的培養(yǎng)液中均能生長(zhǎng)，菌絲生物量存在顯著性差異，其中病菌對(duì)蔗糖和淀粉的利用效果最好。180 r/min搖菌，光照培養(yǎng)7 d后，菌絲生物量分別為2.760，2.613 mg/mL；對(duì)D-甘露醇和D-半乳糖的利用效果次之，其菌絲生物量分別為1.133，1.130 mg/mL；對(duì)葡萄糖、L-山梨醇、麥芽糖、檸檬酸和果糖的利用效果較差，其菌絲生物量小于0.944 mg/mL；對(duì)乳糖的利用效果最差，其菌絲生物量為0.520 mg/mL，與CK中菌絲生物量0.527 mg/mL相比無(wú)顯著性差異（圖8）。

圖8 不同碳源對(duì)TF2009-1菌絲生長(zhǎng)的影響

2.7 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

TF2009-1在供試的9種不同氮源培養(yǎng)液和不加氮源（CK）的培養(yǎng)液中均能生長(zhǎng)，菌絲生物量存在顯著性差異。病原菌對(duì)酵母菌和蛋白胨的利用效果最好，菌絲生物量分別為6.795，6.168 mg/mL；對(duì)甘氨酸、谷氨酸、硝酸銨、氯化銨、硝酸鉀、尿素和硝酸銨的利用效果較差，其生物量均小于1.235 mg/mL，且相互間無(wú)顯著性差異（圖9）。

圖9 不同氮源對(duì)TF2009-1菌絲生長(zhǎng)的影響

表1 菌絲和分生孢子致死溫度測(cè)定

2.8 菌絲體及分生孢子致死溫度測(cè)定

TF2009-1菌絲塊在50℃水浴中處理10 min后其菌絲不能生長(zhǎng)，說(shuō)明菌絲的最低致死溫度為50℃水浴處理 10 min；分生孢子懸浮液在55℃水浴中處理10 min后，分生孢子不能萌發(fā)，說(shuō)明分生孢子的最低致死溫度為55℃水浴處理10 min（表1）。

3 小結(jié)與討論

國(guó)內(nèi)外尚無(wú)C.eleocharidis生物學(xué)特性的相關(guān)報(bào)道。本次荸薺稈枯病菌生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，在連續(xù)光照、12 h光暗交替和連續(xù)黑暗條件下，病菌均能正常生長(zhǎng)，且菌落平均直徑無(wú)顯著性差異；分生孢子在2%水瓊脂平板上均可萌發(fā)，且其萌發(fā)率無(wú)顯著性差異；該菌菌絲在PDA平板上培養(yǎng)時(shí)，在5～35℃內(nèi)其均能生長(zhǎng)，最適溫度為25～30℃；分生孢子在2%水瓊脂平板上，于5～35℃內(nèi)均可萌發(fā)，最適溫度為25～30℃。據(jù)梁鈞等[3]和李清銑等[5]報(bào)道，從廣西和江蘇兩地荸薺稈枯病病莖上分離的荸薺柱盤(pán)孢生長(zhǎng)溫度分別為8～ 32℃和5～32℃，最適溫度分別為25～30℃和23～29℃，其中李清銑等[5]還指出荸薺柱盤(pán)孢分生孢子的萌發(fā)溫度為10～32.5℃，最適溫度22～27.5℃。這與本研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明在中國(guó)南方和中部地區(qū)該菌對(duì)溫度的適應(yīng)能力差異不大。該菌在供試的8種培養(yǎng)液中均能生長(zhǎng)，且菌絲生物量存在顯著性差異，在PDB中菌絲生物量最大，OMB中最小。該菌在供試的8種培養(yǎng)基中均能產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量存在顯著差異，在MBA上產(chǎn)孢量最高，OMA、VA、PSA和PDA上最低。該菌菌絲在pH值為3.0～10.0的PDA培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，且菌落平均直徑存在顯著性差異，pH值為6.0～7.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，pH值為11.0時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)。梁鈞等[3]報(bào)道，從廣西荸薺稈枯病病莖上分離的荸薺柱盤(pán)孢菌生長(zhǎng)最適宜pH值為6.47；李清銑等[3]報(bào)道，從江蘇荸薺稈枯病病菌上分離的荸薺柱盤(pán)孢菌生長(zhǎng)較適宜pH值為4.7～ 7.2，這與本研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明該菌較適宜在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng)。

荸薺稈枯病菌能夠利用多種碳源和氮源，在無(wú)碳或無(wú)氮條件下也能生長(zhǎng)，在不同碳源和氮源中菌絲生物量均存在顯著性差異。供試碳源中以蔗糖和淀粉的利用效果最好，D-甘露醇和D-半乳糖的利用次之，利用最差的是葡萄糖、L-山梨醇、麥芽糖、檸檬酸和果糖，但與CK相比無(wú)顯著性差異。供試氮源中以酵母膏和蛋白胨的利用效果最好，對(duì)甘氨酸、谷氨酸、硝酸銨、氯化銨、硝酸鉀、尿素和硝酸銨的利用效果較差，與CK相比差異不顯著。李清銑等[5]報(bào)道荸薺稈枯病菌在不同碳源中對(duì)淀粉的利用效果最好，其次為果糖和乳糖，麥芽糖利用較差，蔗糖和葡萄糖的利用效果最差，病菌幾乎不能生長(zhǎng)；氮源中以蛋白胨和天冬酰胺利用效果最好。梁鈞等[3]報(bào)道荸薺稈枯病菌在不同碳源中對(duì)葡萄糖、D-甘露醇和蔗糖的利用較好，麥芽糖次之；氮源中則以甘氨酸等的利用效果最好，硫酸銨、硝酸銨、尿素等的利用最差。這與本研究結(jié)果差異較大，推測(cè)可能是由于3個(gè)地方種植的荸薺品種不同，也可能是因?yàn)檩┧j稈枯病菌存在生態(tài)地理型差異。

荸薺稈枯病菌菌絲和分生孢子的最低致死溫度分別為50℃水浴處理10 min和55℃水浴處理10 min。病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)受處理時(shí)間與處理溫度的影響，該試驗(yàn)結(jié)果為選擇適宜的處理溫度和時(shí)間，應(yīng)用熱處理法來(lái)控制荸薺稈枯病提供了參考。不同熱處理方法、時(shí)間和溫度對(duì)病原菌存活力的抑制作用還需要進(jìn)一步的研究。

[2]方中達(dá)．植病研究方法.3版[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[2]黃彰欣．植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1993：56－59.

[3]梁鈞，賴傳雅．荸薺稈枯病菌生物學(xué)性狀研究[J]．廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，14（4）：288－294.

[4]Freeman S,Nizani Y,Dotan S,et al.Control ofColletotrichum acutatumin strawberry under laboratory,greenhouse,and field conditions[J].Plant Disease,1997,81:749-752.

[5]李清銑，王連榮.江蘇荸薺稈枯病的發(fā)生、危害及病原菌鑒定[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，1985（4）：20-22

Research on Biological Characteristic ofCylindrosporium eleocharidis

PAN Li,ZHU Zhixian,LV Rujing,ZHENG Lu,HUANG Junbin
(College of Plant Science Technology,Huazhong Agricultural University/Key Lab of Crop Disease Monitoring and Safety Control in Hubei Province,Wuhan 430070)

Biological characteristic ofCylindrosporium eleocharidisindicated that the range of temperature for mycelia growth and conidia germination both were 5-35℃,and the optimal range of temperature for both were 25-30℃;potato dextrose liquid medium (PDB)was the most favorable for mycelium growth,and mung bean agar medium (MBA)was the optimal for sporulation.The range of pH value for mycelia growth was 3-11,with the optimal pH value of 6-7.Among the tested carbon and nitrogen source in Czapek liquid medium,sucrose,amylum,yeast extract and peptone were the most favorable for mycelia growth.The lethal temperature for mycelia and conidia was 50℃,10 min and 55℃,10 min,respectively.This is the first report of biological characteristic ofC.eleocharidisin Hubei province,the causal agent of Chinese water chestnut stem blight.

Chinese water chestnut;Stem blight;Cylindrosporium eleocharidis;Biological

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.027

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（200903017）

黃俊斌（1963-），男，通信作者，教授，研究方向?yàn)橹参镎婢『εc分子植物病理學(xué)，E-mail：junbinhuang@mail.hzau.edu.cn

2011-07-05