精制橄欖油細菌內毒素檢查的可行性研究*

潘衛松 肖 瑛

（1.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州510610；2.暨南大學藥學院，廣東廣州510632；3.暨南大學中藥藥效物質基礎及創新藥物研究廣東省高校重點實驗室，廣東廣州510632）

橄欖油系由油橄欖的成熟核果提煉制成的脂肪油，為常用藥用輔料、溶劑和分散劑。《中國藥典》2010年版二部在正文品種第二部分中收錄該品種，但并未對其細菌內毒素進行控制，由此限制了其在注射劑中的應用。為此，本研究參照現行中國藥典收載的細菌內毒素檢查法[1，2]，對精制橄欖油進行了細菌內毒素檢查的方法研究，現報道如下。

1 儀器與試藥

TW12六孔恒溫水浴（Julabo公司）；MSI旋渦混合器（廣州IKA公司）；XS204電子天平（METTLER TOLEDO公司）。

細菌內毒素工作標準品（規格：每支120EU，批號：150601－200699）由中國藥品生物制品檢定所提供；細菌內毒素檢查用水（BET水，規格：每支50mL，批號：1007161）及鱟試劑（TAL）A（規格：每支0.1mL，批號：1005071，靈敏度：0.25EU/mL）購自湛江安度斯生物有限公司；TAL B（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，規格：每支0.1mL，批號：100101，靈敏度：0.25EU/mL；精制橄欖油德國Lipoid GmbH公司，批號：799395，799399，799398。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值的確定

根據企業資料，本品細菌內毒素限值為3EU/g。

2.2 鱟試劑靈敏度復核試驗

鱟試劑標示靈敏度（λ）的復核按照2010年版《中國藥典》（二部）附錄細菌內毒素檢查法規定進行。結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

由表1可見，3批鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ之間，符合進行細菌內毒素檢查的規定。

2.3 干擾預試驗[3-5]

2.3.1 最小有效稀釋濃度 最小有效稀釋濃度c=λ/L，L=0.1 EU/mg，用于藥品檢驗的市售鱟試劑靈敏度一般在 0.25

～0.03EU/mL之間，故精制橄欖油進行細菌內毒素檢測時，0.25～0.03EU/mL的鱟試劑相對應的最小有效稀釋濃度為83.4mg/mL、41.7mg/mL、20.8mg/mL、10.4mg/mL。

2.3.2 預試驗 取3批精制橄欖油，用卵磷脂溶液適量及BET水將樣品稀釋成83.4mg/mL、41.7mg/mL、20.8mg/mL、10.4mg/mL共4個濃度梯度的溶液，將此系列濃度溶液標記為供試品管（NPC系列）。用上述稀釋液作為溶劑，溶解并稀釋細菌內毒素工作標準品，制得每個稀釋度中細菌內毒素含量均為2λ（0.5EU/mL和0.25EU/mL）的精制橄欖油溶液，標記此系列溶液為供試品陽性對照管（PPC系列）。取靈敏度為0.25EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑進行試驗，每一稀釋度做2管，同時按常規分別設細菌內毒素陽性對照（PC）和檢查用水陰性對照（NC）各2管，結果見表2。

表2 樣品干擾預試驗結果

從表2可見，所用的3批精制橄欖油稀釋到83.4mg/mL或以下濃度的溶液時，對兩個廠家的鱟試劑與細菌內毒素反應均無增強或抑制的干擾作用。

2.4 正式干擾試驗

用兩個廠家的鱟試劑（靈敏度為0.25EU/mL），按現行中國藥典方法進行試驗，測定用BET水制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Es）和用供試品稀釋液制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Et）。取3批精制橄欖油，分別加卵磷脂溶液適量及 BET水稀釋成 83.4mg/mL（批號：799395，799399，799398），用BET水和供試品稀釋液將細菌內毒素工作標準品稀釋成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ濃度的BET水系列細菌內毒素溶液和供試品稀釋液系列細菌內毒素溶液，每一稀釋濃度重復4管，同時用上述供試品稀釋液和BET水各做2管陰性對照管，按下列公式計算BET水和供試品稀釋液反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et），Es=lg-1（∑Xs/4），Et=lg-1（∑Xt/4），結果見表3。

從表3結果可見，2λ管均為陽性，0.5λ、0.25λ管均為陰性，對于λ=0.25EU/mL的2組鱟試劑的Es為0.25EU/mL，Es均在0.5λ～2.0λ范圍內，3批精制橄欖油測得的Et均在0.5λ～2.0λ范圍內，Et和Es的比值在0.5～2.0之間，說明精制橄欖油在83.4mg/mL或以下濃度的溶液對兩個不同廠家的鱟試劑與內毒素的反應無增強或抑制的干擾作用，符合現行中國藥典對細菌內毒素檢查有效性的規定，因此可以確定精制橄欖油的最大無干擾濃度為83.4mg/mL。

表3 樣品（83.4m g/m L）干擾試驗結果

2.5 樣品細菌內毒素檢查

取3批精制橄欖油，分別根據“2.4”項下方法制成供試品稀釋液，使用λ=0.25EU/mL的兩個廠家的鱟試劑進行細菌內毒素檢查，并用此稀釋液將細菌內毒素工作標準品稀釋為2λ的溶液，作為供試品的陽性對照，另外以細菌內毒素檢查用水建立陽性對照和陰性對照。按現行中國藥典部細菌內毒素檢查法檢查，結果見表4。陰性對照管（NC）均為陰性，供試品陽性對照管（PPC）和陽性對照管（PC）均為陽性，實驗成立；供試品管（NPC）均為陰性，表明樣品中未檢出細菌內毒素，3批精制橄欖油的細菌內毒素檢查均符合規定。

表4 樣品細菌內毒素檢查結果

3 討論

熱原檢查是腸外給藥制劑及原料重要的質量控制項目。細菌內毒素檢查法目前已被各國藥典廣泛采納，作為替代熱原檢查法的體外檢測方法之一應用于藥品的質量控制，但該方法存在易受到各種檢測因素干擾的缺點，故在中藥制劑，生物制品和藥用輔料的檢測上還存在著不少限制。本研究探討了細菌內毒素檢查法應用于藥用輔料的可行性，為提高藥用輔料的質量標準進行了初步的探索[6-8]。

不同廠家的鱟試劑由于生產工藝，質量參數等方面有一定差異，其抗干擾能力也存在差異。因此，本研究采用兩個不同廠家不同靈敏度的鱟試劑對3個批號的樣品進行試驗。從正式干擾試驗結果可見，樣品稀釋至83.4mg/mL濃度時，Es或Et均在0.5～2.0范圍之內，可認為精制橄欖油在該濃度下不干擾細胞內毒素檢查。

用兩個廠家鱟試劑與3批樣品進行細菌內毒素檢查，樣品中細菌內毒素限量均在3EU/g限值以下。因此，藥用輔料精制橄欖油采用限值3EU/g進行細菌內毒素檢查法控制熱原質是可行的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄99.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：1252.

[3]汪穗福，蘇廣海，勞海燕，等.對中國藥典（2005年版一部）細菌內毒素檢查法的建議[J].中醫藥信息，2004，21（1）：57-58.

[4]潘衛松，肖瑛.透明質酸鈉注射液細菌內毒素檢查法的研究[J].中國醫藥導報，2009，6（6）：45-47.

[5]潘衛松，肖瑛，潘建明.熒光素鈉注射液細菌內毒素檢查法的研究[J].中國藥房，2009，20（13）：1010-1012.

[6]周永標，潘衛松.從葛根素的異常毒性實驗看藥用輔料的重要性[J].中國醫藥導報，2010，7（13）：47-48.

[7]潘衛松，肖瑛，李薇.皮膚組織中SOD活性測定的樣品制備方法[J].中國醫藥導報，2010，7（32）：27-28.

[8]潘衛松，劉美鳳，石鉞，等.血清藥理學、血清化學和中藥藥代動力學[J].世界科學技術一中藥現代化，2002，4（3）：53-56.