P-選擇素在糖尿病中的研究進展＊

顧慧群綜述 王偉靈審校

P-選擇素在糖尿病中的研究進展＊

顧慧群綜述 王偉靈審校

本文2011—02—28收到，2011—03—11修回，2010—03—18接受

細胞黏附分子選擇素家族的重要成員P-選擇素（P-se-lectin），儲存于靜止血小板的α顆粒和血管內皮細胞棒管狀小體內。當血栓形成或炎癥刺激致血小板活化時，其顆粒膜與胞質膜融合，通過胞吐作用，P-選擇素迅速暴露于血小板和內皮細胞表面，在炎癥反應和血栓形成初期起主要作用。高血糖是糖尿病微血管病變的病理學基礎之一。高血糖引起血紅蛋白糖基化，使組織缺氧和脂肪代謝紊亂，導致內皮細胞損傷和血小板活化，使P—選擇素表達增加。P-選擇素水平檢測作為糖尿病患者血栓形成風險預測因子，在臨床防治過程中起到一定的作用，因而得到較多應用。本文就P-選擇素的結構、生物學效應和實驗室檢測以及在糖尿病、糖尿病心臟病中的作用作一綜述。

1 P-選擇素的生物學效應

1.1 P-選擇素的結構及作用

P-選擇素又稱α顆粒膜蛋白140，依賴血小板激活的顆粒外膜即CD62p，是高度糖基化的單鏈跨膜糖蛋白。其結構特點是氨基端有約120個氨基酸的凝集素樣區，以及約40個氨基酸的表皮生長因子（EGF）樣區和九個相似的補體調節蛋白（Complement Regulatory Protein，CRP）串聯重復序列。P-選擇素的凝集素樣區，可識別配基中唾液酸化的氨基多糖結構Lewisx，表達唾液酸化的Lewisx的細胞均可以與P—選擇素結合。因此測定血漿P-選擇素濃度可以評估體內血小板活化及內皮損傷程度［1］。

P-選擇素屬于選擇素家族，在人和小鼠位于1號染色體，組成一個基因決定簇。選擇素主要包括P—選擇素、E-選擇素、L-選擇素，由胞外區的凝集素、表皮生長因子、CRP重復序列以及跨膜區與胞質區組成，P、E、L-選擇素是根據CRP重復序列的不同進行分類的。新合成的P-選擇素首先儲存在Weibel-Palade小體，在炎癥介質如組胺、凝血酶等刺激下，通過胞質膜融合釋放，形成P-選擇素在細胞表面的再分配。高表達的P-選擇素可通過P-選擇素糖蛋白配體l（PSGL-1）介導血小板、內皮細胞及白細胞間的細胞初始黏附以及白細胞沿血管壁內皮滾動，啟動和促進血栓形成及局部白細胞黏附聚集［2，3］。

P—選擇素可以直接興奮中性粒細胞，也可增強血小板活化因子（PAF）和其它激動劑興奮中性粒細胞的能力，如將外周血中性粒細胞和單核細胞與血小板共孵育可產生超氧負離子，超氧負離子的產生量依賴于共孵育的時間和血小板濃度；激活的血小板增強白細胞超氧負離子的作用可以被P—選擇素抗體、抗Sialyl-1ewisx抗體或可溶性重組P—選擇素融合蛋白抑制［4］。

P-選擇素可以促進白細胞的游走［3］。白細胞上有P-選擇素最重要的配體PSGL-l，PSGL-1是一個同型二聚體，每個亞基的分子量為120 k D，表達在各種類型的白細胞上。P—選擇素與PSGL-1相互作用，形成血小板—白細胞聚集體，后者對血液凝固和炎癥過程起非常重要的作用。

P-選擇素還可以調節血小板的游走和CD40L（腫瘤壞死因子家族成員）的表達。血小板CD40L的表達增加及血漿可溶性CD40L受體升高都具有促血栓形成作用，CD40L與細胞膜上的CD40L受體結合可促進炎癥細胞因子、白介素（IL-2、IL-8）、單核細胞趨化蛋白、組織因子（TF）的合成增加，并且上調黏附因子的表達［6］，從而促進在動脈粥樣硬化的發展，是心血管事件的危險因素。

P-選擇素還可以穩定血小板聚集物，并且決定血小板聚集物的體積，在止血和血栓形成中起到非常重要的作用［7］。

1.2 P-選擇素的檢測

1.2.1 ELLSA：P-選擇素有兩種變型，即可溶性 P—選擇素和膜P-選擇素。可溶性P-選擇素在血液中以單體的形式存在于血漿或血清中。檢測標本宜置于—80℃保存，避免反復凍融。采用酶聯免疫吸附試驗雙抗體夾心ABC-ELlSA法測定，即用純化的人P-選擇素抗體包被微孔板，制成固相抗體，與待測標本中的P-選擇素結合，再與HRP標記的P-選擇素抗體結合，形成抗體—抗原—酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色，TMB在HRP的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中的P—選擇素濃度呈正相關。用酶標儀測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品P-選擇素濃度。

1.2.2 流式細胞術（FCM）：利用流式細胞術檢測血小板膜上P-選擇素的含量是公認的判定血小板活化狀態的 “金標準”［8］。流式細胞術檢測血小板膜上活化標記物P-選擇素（CD62p）的優點為：直接應用全血檢測，可反映血小板生理狀態下的功能，同時簡化了標本的處理，最大限度地減少了人為活化血小板，避免了因離心導致的血小板體外激活，并防止血小板亞群的丟失；且標本用量少，尤其適用于兒童和血小板減少癥患者；還能檢測出少到1%的活化血小板亞群及單個或亞群血小板膜活化標志物。其不足之處是價格較昂貴，操作復雜。

1.2.3 時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）：其原理是將三價稀土離子（如Eu3＋）作為示蹤物，通過這些稀土離子與具有雙功能結構的螯合劑以及抗原形成稀土離子—螯合劑—抗原螯合物。當標記抗原、待測抗原共同競爭抗體，形成免疫復合物時，利用時間分辨熒光分析儀，即可測定復合物中稀土離子發射的熒光強度，從而確定待測抗原的量。TRF1A克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素帶來的污染問題，也克服了酶免疫分析法（EIA）中酶的不穩定性缺點，并且能夠很好的消除背景熒光的干擾，使其靈敏度比普通熒光法（FIA）高出幾個數量級。

朱瑩瑩等［9］對以上3種方法進行比較后發現，用FCM、ELISA及TRFIA的結果是相聯系的、一致的。ELISA儀器價格便宜，適合在基層單位應用；TRFIA的靈敏度高，操作方便，但儀器價格較貴；FCM用血量少，勿需分離血漿，檢測速度快，只是批間差異較大，儀器價格較貴。以上3種方法尚需進一步標準化。

2 P-選擇素在糖尿病中的作用

糖尿病患者微血管病變和大、中血管病變的發生率較高。微血管病變主要是視網膜眼底病變、腎臟病變、肢體末端壞疽等。大、中血管病變主要為動脈粥樣硬化，多累及心、腦血管，引起冠心病和腦血管意外。長期高血糖引起血紅蛋白的糖基化，使組織缺氧和脂肪代謝紊亂，導致內皮細胞損傷和血小板活化，增加血小板P-選擇素表達，促進血小板聚集。

2.1 P-選擇素與糖尿病微血管病變

長期高血糖可導致糖尿病患者內皮細胞高度表達P—選擇素及增強白細胞黏附，而胰島素能明顯抑制P—選擇素表達及其介導的白細胞黏附，因此推測糖尿病微血管病變與P-選擇素介導的細胞黏附、血栓形成及促進炎癥有關［10］。研究發現，糖尿病患者的血小板活化在無腎臟微血管病變時已經存在，只不過在發生了腎臟微血管病變后血小板活化更加明顯，且釋放出大量P—選擇素，參與微血管病變的過程，而不是微血管病變的結果［11］。

糖尿病視網膜病變與微血管的損害和毛細血管堵塞有關，血小板以及單核細胞、巨噬細胞、粒細胞可能參與堵塞毛細血管，因在糖尿病患者的視網膜和腎臟的毛細血管中發現有血小板聚集物和血栓形成；近年研究發現糖尿病患者視網膜血管中可溶性P-選擇素水平增加［12］。

糖尿病腎?。―N）是糖尿病嚴重的微血管并發癥，也是糖尿病患者的重要死亡原因之一。王鋒等［10］研究發現，糖尿病患者血漿P—選擇素的水平高于正常組，而DN患者的P—選擇素水平明顯高于無并發癥的糖尿病患者，表明P—選擇素水平對判斷DN的發生和發展有一定價值。Omoto等［13］研究也證明，DN外周血P—選擇素陽性者，血小板數量比正常對照組及無并發癥糖尿病組明顯升高，在給予抗血小板藥物后，P-選擇素陽性患者的血小板計數水平顯著下降。此外Hirata等［14］發現，DN患者腎組織中P-選擇素沿著腎小球、間質毛細血管分布，與其它腎病（如微小病變性腎病、Ig A腎病及狼瘡性腎炎等）相比，其表達顯著增加。表明P-選擇素的高度表達與腎小球硬化、間質纖維化有密切關系。近年來的臨床研究對P-選擇素在DN中所起到的致病作用給予了充分的認可，抗血小板藥物在體內外實驗中能有效抑制（如高糖等誘導）P-選擇素的高度表達，并且發現抗凝治療DN的新方法。這些研究成果將為進一步闡明DN與P—選擇素的關系及臨床治療提供了良好的思路與基礎［15］。

P—選擇素還可能成為糖尿病微血管病變的早期預測指標［16］。高血糖使紅細胞膜變硬、血粘度增高，導致局部血流停滯，循環受阻，引起糖尿病患者肢體末端的微血管病變，形成糖尿病足壞疽。P-選擇素在糖尿病足壞疽患者中的高表達，有利于血栓風險的預測及抗血栓治療。

2.2 P-選擇素與糖尿病心臟病的關系

研究［17］表明，高血糖可刺激內皮細胞表達P-選擇素及心肌細胞分泌單核趨化蛋白-1（MCP-1），后者誘導單核巨噬細胞通過PSGL-1與內皮細胞表面的P-選擇素以配體—受體模式相互作用，最終透過內皮形成泡沫細胞。糖尿病心臟病時P-選擇素和MCP-1之間亦可能相互促進表達，從而趨化單核巨噬細胞至心肌細胞間質及使心肌細胞間質等細胞外基質沉積增多，而 MCP-l可使心肌膠原蛋白I表達增多，心肌纖維增粗，心肌僵硬度增加［18］，從而共同參與糖尿病心臟病的發病。長期高血糖毒性作用能誘導P—選擇素表達增多，導致血漿和組織蛋白質非酶糖基化，形成晚期糖基化終末產物，心肌中較多糖蛋白和晚期糖基化終末產物的形成和沉積，可導致心肌收縮功能和順應性減低，影響和損害組織或臟器功能。研究［19］證明，心臟舒張功能受損程度與P-選擇素濃度有關。

2.3 P-選擇素與糖尿病腦血管并發癥

在糖尿病合并腦血管并發癥時，P-選擇素在血漿中的表達也是增加的。有研究發現2型糖尿病合并腦血管并發癥血小板P—選擇素表達與2型糖尿病無血管并發癥和正常對照相比顯著增加。

3 結 語

臨床分析表明，糖尿病、高血壓、高脂血癥患者，甚至健康吸煙者，其體內P—選擇素水平明顯高于正常人群［20］。與其它血小板標志物比較，P-選擇素可以更靈敏地反映血小板活性。P-選擇素一方面可以作為活化血小板的標志物，反映血栓前狀態，提示血栓形成傾向；同時也是抗血小板治療抑制血小板活化、減輕患者高凝狀態、改善糖尿病并發癥的有效監測指標之一。另一方面，P-選擇素本身也是一個重要的導致血栓形成的致病因素；而針對P—選擇素靶標的抗血栓、抗黏附治療，可能會成為抗血栓形成的有效防治手段。所以，對P—選擇素生物學效應及其與糖尿病、DN、糖尿病心臟病、糖尿病腦血管并發癥等的關系和機制的深入認識和研究，有助于糖尿病患者血栓事件的預防，同時也為抗血小板藥物的應用和研發提供理論依據。

本文作者簡介：

顧慧群（1978～），女，漢族，醫學學士，主管技師，主要從事止血與血栓檢驗工作

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