白毛藤對人胃癌BGC-823細胞增殖及凋亡的影響*

楊旭東,張 杰,楊驕霞

(1.牡丹江醫學院,黑龍江牡丹江 157011;2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院,黑龍江牡丹江 157011)

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一,化學療法在胃癌治療中占有重要的地位,但其存在一定的不良反應和耐藥性。隨著醫學水平的不斷提高,中藥已經成為當今治療腫瘤的重要手段,其優勢在于中藥不但對腫瘤具有抑制作用、不易產生耐藥性,而且對機體的損傷和副作用較小,因而中藥抗腫瘤作用及其機制的研究已成為我國科學工作者的重要研究課題之一。白毛藤(Solamum lyratum Thunb)系茄科植物白英的全草,具有清熱利濕、消腫解毒之功效[1]。它作為抗癌中藥之一,已被證明水提物在體外有較強的腫瘤細胞增殖抑制活性[2],但有關機制并不明確。本研究通過檢測重要的凋亡調控基因bcl-xl及抑癌基因 p53基因等指標,觀察了白毛藤對人胃癌BGC-823細胞的影響,以期探討其作用機制,為其應用于胃癌的臨床治療提供理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人胃癌BGC-823細胞株,由武漢中美科技有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

MTT試劑,泰倫生物科技有限公司產品,批號041025;Trizol,Sigma公司產品,批號15596-018;引物核苷酸片段,上海生工生物技術有限公司產品。550型酶標儀,美國BIO-BAD公司產品;Epics-XLⅡ型流式細胞儀(FCM),美國BD公司產品。

1.3 細胞培養

將BGC-823細胞培養于含 10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中,置于37℃、5%CO2的培養箱中培養,細胞貼壁生長,用 0.25%胰酶和0.02% EDTA 1∶1消化傳代。

1.4 分 組

白毛藤組:用RPMI 1640培養液倍比稀釋的2,4,8和16 g/L的白毛藤水提液。對照組:用含BGC-823細胞的RPMI 1640培養液。

1.5 檢測指標

1.5.1 細胞增殖抑制率

采用MTT比色法測定。收集對數生長期腫瘤細胞,調整細胞密度為1×105個/mL,每孔 100μL接種于 96孔板中。每個劑量設 12個平行孔,分別培養12,24和48 h;再加入5 g/L MTT 20μL(調零組除外),繼續培養4 h;吸棄上清液,每孔加入150μL DMSO溶解樣品,采用酶標儀測定各孔490 nm(OD)值。比色時以RPMI 1640培養液調零。按公式計算細胞生長抑制率(inhibition rate,IR)。IR=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)× 100%。

1.5.2 細胞周期及細胞凋亡情況

將培養48 h后的各組細胞制成單細胞懸液,用70%乙醇4℃處理過夜;PBS洗滌1次,RNA酶(20mg/L)37℃消化30min;PBS洗滌1次,碘化丙啶(50mg/L、4℃)避光染色30min,取1×105細胞/mL,用流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡情況。

1.5.3 細胞形態觀察

收集對數生長期腫瘤細胞,調整細胞密度為1× 105個/mL,分設實驗組和對照組,培養 72 h后,于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.5.4 Bcl-xl、P53表達

提取腫瘤細胞總RNA,用RT-PCR方法檢測腫瘤細胞bcl-xl、p53基因表達。bcl-xl上游引物為5′-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3′,下游引物為5′-GCGATCCGACTCACCAATAC-3′,擴增片段448 bp。p53上游引物為5′-TTCTCTCCCCAACAATGAGG-3′,下游引物為5′-TCTGTGAAGCAGCACCATTC23′,擴增片段531 bp。β-Action上游引物為5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′,下游引物為5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′,擴增片段838 bp。反應條件:94℃預變性5 min;變性30 s(94℃),退火30 s(58℃),延伸1min(72℃),共30個循環,最后72℃延伸7m in。經凝膠成像系統分析,分別計算bcl-xl、p53與內參擴增帶熒光強度 ×面積的比值,得出bcl-xl、p53 mRNA的相對表達量。

1.6 統計學方法

采用SPSS 11.5統計分析軟件處理。計量資料數據以均數(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標準差(s)表示,組間比較采用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 白毛藤對胃癌BGC-823細胞增殖的影響

同一濃度白毛藤隨著作用時間延長對細胞增殖反應抑制作用明顯增強。隨著濃度增加,細胞增殖抑制作用增強。見表 1。由此表明,白毛藤抑制胃癌細胞的增殖,呈濃度和時間依賴性。

2.2 白毛藤對胃癌BGC-823細胞周期及凋亡率的影響

隨著濃度增加 G2/M期細胞的百分比逐漸增加,說明細胞阻滯在G2/M期。隨著濃度增加,細胞凋亡率逐漸增加,表明白毛藤具有明顯誘導細胞凋亡作用。見表 2。

表1 各組胃癌BGC-823細胞生長抑制率對比 ±s

表1 各組胃癌BGC-823細胞生長抑制率對比 ±s

注:與白毛藤2 g/L組對比,*P＜0.05,**P＜0.01。

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表2 各組48 h后胃癌BGC-823細胞周期和凋亡率對比

2.3 白毛藤對胃癌BGC-823細胞形態的影響

與對照組對比,白毛藤各組胃癌細胞貼壁不牢,懸浮細胞增多,細胞體積變小,伴核固縮,胞質內黑色顆粒增多,培養基中可見大量細胞碎片,以16 g/L組處理48 h表現最為明顯。

2.4 白毛藤對胃癌BGC-823細胞bc1-xl和p53基因表達的影響

與對照組相比,不同濃度白毛藤作用 48 h后,腫瘤細胞中抑癌基因 p53基因表達逐漸增加、原癌基因bcl-xl基因表達逐漸降低,以16 g/L組最明顯。見表 3及圖 1～2。

表3 各組胃癌BGC-823細胞bc1-xl和p53表達情況對比 ±s

表3 各組胃癌BGC-823細胞bc1-xl和p53表達情況對比 ±s

注:與對照組對比,#P＜0.05,##P＜0.01。

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3 討 論

目前,治療腫瘤的多種化療藥物主要是通過影響腫瘤細胞周期和誘導細胞凋亡來達到抑制腫瘤細胞增殖目的的,但化療藥物對腫瘤細胞選擇性較差,在殺死腫瘤細胞的同時也殺死正常細胞,毒副作用大。因此,從天然產物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物,已成為抗腫瘤藥物研究的重要組成部分。白毛藤已被證實有較強的腫瘤細胞增殖抑制活性。

細胞周期和細胞凋亡是一個緊密聯系、高度協調的過程,其在腫瘤細胞的發生、發展過程中起著重要的作用。細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡 ,是在精密調節下的細胞的主動死亡過程,在個體生長發育過程中起重要作用。細胞凋亡的異常與多種病理生理過程相關,如腫瘤的發生發展、動脈粥樣硬化、自身免疫疾病等。bcl基因家族是重要的凋亡調控基因,包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因bax、bak、bcl-xs等[3]。bcl-xl過表達與腫瘤發生有密切關系,能抑制化療等引起的凋亡,而下調其表達則能促進凋亡發生[4]。p53基因為抑癌基因,存在于正常細胞核中,對細胞損傷分化有抑制作用,具有促進細胞凋亡的作用[5]。p53編碼多功能的抑癌蛋白 p53,主要功能是在檢測基因組損傷、啟動修復損傷基因組從而維持基因組穩定,在抑制或阻止細胞轉化、誘導基因組損傷的細胞凋亡等方面起到決定性作用,從而抑制腫瘤的發生、去除衰老細胞等[6]。

本研究結果顯示:①白毛藤抑制胃癌細胞增殖,具有時效和量效關系,時間越長,濃度越大,抑制作用越明顯。②白毛藤可以明顯上調p53基因mRNA表達,降低bcl-xl基因mRNA表達。③白毛藤使G2/M期細胞的百分比逐漸增加,凋亡細胞增加。根據以上結果,是否可以推斷白毛藤是因為上調p53基因mRNA表達、降低bcl-xl基因mRNA表達使細胞周期阻滯在G2/M期而實現了抗胃癌細胞增殖及促進凋亡作用,此是否是其抗腫瘤機制之一,是否可以為白毛藤治療胃癌乃至所有腫瘤提供一個新的藥物作用靶點,在實驗動物體內是否具有上述作用等疑問,尚有待于進一步證實。

[1]馮洪錢.民間獸醫本草[M].北京:科學技術文獻出版社,1993:370-308.

[2]施文榮,劉艷.白英對人急性早幼粒白血病 HL 60細胞生長的影響[J].福建中醫學院學報,2002,12(1):36-38.

[3]Nicholson DW.Thomberry NA.Apop tosis:life and death decision[J].Science,2003,299(5 604):214-215.

[4]Pena JC,Thompson CB,RecantW,et al.Bcl-xl and bcl-2 expression in squamous cell carcinoma of the head and neck[J].Cancer,1999,85(1):164-170.

[5]Tordan J,Galmdo MF,Piehn JH,et al.P53expression induces apop tosis in hippoocampal Pyramidal neuron cultures[J].J Neurosci,1997,17(4):1 397-1 405.

[6]Riley T,Sontag E,Chen P,etal.Transcriptional control of human p53-regulated genes[J].Nat Rev Mol Cell Biol, 2008,9(5):402-412.