消巖湯藥物血清對A549/DDP細胞凋亡的誘導作用*

張 瑩,賈英杰,楊 潔,李小江

(1.天津中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科,天津 300193;2.天津中醫藥大學 2007級碩士研究生,天津300193)

腫瘤細胞的多藥耐藥性(multid rugresistance, MDR)是肺癌化療的重要障礙。化療可以通過多種途徑介導細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞,因此腫瘤細胞對凋亡的耐受是多藥耐藥的一個重要機制[1]。前期研究證實,消巖湯含藥血清對A 549及A549/DDP均有生長抑制作用,且能增強順鉑(DDP)對耐藥細胞(A 549/DDP)的殺傷作用,具有耐藥逆轉作用[2]。本研究以人肺腺癌A549和A549/DDP細胞株為受試對象,研究了消巖湯荷瘤動物藥物血清對細胞凋亡的影響,旨在進一步闡明消巖湯的抗耐藥機制,為其應用于腫瘤的臨床治療提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康昆明種小鼠(KM)60只,SPF級,雄性,4～6周齡,體質量(20.99±1.87)g,購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司,飼養設施 1級,動物質量許可證號:SCXK(津)2009-0001。

1.2 藥 物

消巖湯組成:黃芪10 g,西洋參10 g,姜黃10 g,郁金10g,蘄蛇10 g,夏枯草10 g,生牡蠣10 g,白花蛇舌草10 g。規格100mL/瓶,由本院制劑室生產,生產時間 2009年 1月,批號 20090102。水煎濃縮劑制備方法參照《中藥藥物實驗方法學》[3],將消巖湯于旋轉蒸發器上濃縮成每毫升相當于原生藥材 1.5 g的藥液,冷卻裝入滅菌藥瓶,置4℃冰箱備用[3]。

1.3 瘤 株

S180(腹水瘤)瘤株,由天津藥物研究所提供。

1.4 試劑與儀器

RPMI1640培養基,Gibco公司產品;新生胎牛血清,杭州四季青生物工程公司產品;超凈工作臺,蘇州凈化設備公司產品;BB5060UVCO2細胞培養箱,德國Heraeus公司產品;流式細胞儀,美國BECKMAN-COULTER公司產品。

1.5 細胞系

人肺腺癌細胞系 A549,由天津市藥物研究所提供;耐順鉑(DDP)肺腺癌細胞系A549/DDP,購自中國科學院腫瘤研究所。

1.6 荷 S180腫瘤小鼠模型的建立

小白鼠適應性飼養3 d后,稱重,根據隨機數目表數列隨機分為消巖湯高劑量組、消巖湯低劑量組、模型對照組 3組,每組 20只。體外復蘇,培養 S180細胞,在細胞的對數生長期收集細胞。1 500 r/min離心5 min,D-Hank's溶液洗滌2次,離心棄上清液,離心管外周以冰袋來維持溫度在4℃左右,以此來保持瘤細胞的活性。用生理鹽水稀釋,調整細胞濃度到 1×106/mL。每只小鼠右前腋下皮下接種0.2m L[4],即得。

1.7 給藥方法與劑量

小鼠于接種 S180腫瘤細胞 24 h后,高劑量組按消巖湯 40 g/kg灌胃給藥;低劑量組按消巖湯20 g/kg灌胃給藥;模型對照組以0.4m L生理鹽水灌胃。每次灌胃間隔24 h,連續10 d。

1.8 取血與藥物血清制備

末次灌胃1 h后,稱量小鼠體質量,以眼眶取血法采血,無菌分離血清,56℃下30min滅活處理,然后用0.22μm微孔濾膜過濾除菌,置-20℃保存備用。

1.9 流式細胞儀Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞A549和A549/DDP細胞,更換培養液,分別加入消巖湯高劑量組、消巖湯低劑量組、模型空白動物組血清繼續培養 24 h。0.25%胰酶消化,A 549及A549/DDP懸浮細胞直接收集到10 mL的離心管中,每個樣本細胞數為 1×106/m L, 1 000 r/min離心5 m in,棄去培養液。用4℃預冷的PBS洗滌細胞2次,1 000 r/min離心5min,棄上清液。用三蒸水按 1∶4稀釋結合緩沖液。用 4℃預冷的PBS洗滌細胞2次,用250μL結合緩沖液重新懸浮細胞,調節其濃度為 1×105/m L。用 100μL細胞懸液于5mL流式管中,加入5 m L Annexin V/ FITC和5mL PI溶液。混勻后室溫避光孵育15 min。流式細胞儀激發光波長為 488 nm,發射波長為530 nm,Annexin V/FITC的綠色波長通過FITC通道(FL1)檢測;PI紅色熒光通過PI通道(FL3)檢測。

1.10 結果評價方法

左上象限PI陽性而Annexin V陰性提示為細胞碎片,右上象限PI和Annexin V均陽性為壞死細胞,左下象限PI和Annexin V均陰性為活細胞,右下象限PI陰性而Annexin V陽性為凋亡細胞。

1.11 統計學方法

采用SPSS 11.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標準差(s)表示,以一步方差ANOVA分析組間差別,并經LSD檢驗,以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

在消巖湯藥物血清作用 A549細胞 24 h后,消巖湯低劑量組、消巖湯高劑量組細胞凋亡率分別與模型對照組比較,差別均有統計學意義(P＜0.05)。在藥物血清作用于A549/DDP 24 h后消巖湯低劑量組與模型對照組對比,細胞凋亡率差別無統計學意義(P＞0.05);而消巖湯高劑量組與模型對照組對比,凋亡率差別則有統計學意義(P＜0.05)。表明消巖湯荷瘤動物藥物血清對A 549和A549/DDP均有一定的促凋亡作用;消巖湯對順鉑誘導的A549/DDP耐藥細胞的凋亡具有顯著的增強作用;在一定范圍內,細胞凋亡率與消巖湯濃度呈正相關。見表1。

表1 AnnexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡率 %,±s

表1 AnnexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡率 %,±s

注:與模型對照組對比,*P＞0.05,**P＜0.05。

?

3 討 論

腫瘤細胞對現有抗癌藥物的耐受是目前肺癌化療失敗的主要原因。尋找既能有效克服腫瘤細胞耐藥、毒副作用又小的抗癌藥物,是目前臨床上急需解決的問題。研究表明,所有腫瘤細胞都存在凋亡抑制現象[5],細胞凋亡受抑與 MDR發生密切相關。肺癌細胞在化療藥物誘導條件下的耐藥表型改變都是為了抵抗藥物殺滅,保護自身生存,凋亡途徑異常與耐藥發生緊密聯系,多藥耐藥肺癌細胞的實質是抗凋亡[6],因此采取適當的方法促進或誘發耐藥細胞凋亡是克服肺癌MDR的又一重要策略。

消巖湯是在“解毒祛瘀,扶正抗癌”中醫學治療腫瘤治則基礎上,依據現代藥理研究研制出的院內制劑,具有多種抗腫瘤活性,是治療非小細胞肺癌的良好輔助用藥[7-8]。方中黃芪、西洋參滋陰益氣,扶正以驅邪;姜黃、郁金行氣解郁,活血祛瘀;伍以蘄蛇更搜剔絡脈中之瘀毒;夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草相伍以清熱解毒,軟堅散結。全方祛邪而不傷正,全面調節機體的陰陽平衡。現代藥理學證明:方中單藥有不同程度的抗癌、逆轉多藥耐藥作用。姜黃素對人肺腺癌A549/DDP細胞增殖具有抑制作用,其作用機制可能是通過阻滯細胞周期進程和誘導細胞凋亡來實現的[9]。人參皂苷單體 Rb1具有鈣離子通道拮抗作用從而逆轉腫瘤MDR[10]。

流式細胞儀檢測凋亡的方法有多種,其中以磷脂結合蛋白Annexin V-FITC/PI雙標記染色最為常用。經前期研究證實,消巖湯具有耐藥逆轉作用[2]。本研究結果提示,消巖湯能夠誘導發生MDR的A 549/DDP細胞發生凋亡,盡管機制不清,這仍為消巖湯對耐藥肺癌患者提供了有效的實驗依據,可為臨床提供有效的MDR逆轉措施,使肺癌患者得到更有效的治療。

[1]陳衛強,戚好文,吳昌歸,等.雙氫青蒿素和順鉑誘導人肺腺癌A549/CDDP細胞凋亡[J].現代腫瘤醫學,2007, 15(5):616-619.

[2]張瑩,賈英杰,楊潔,等.消巖湯藥物血清對A 549/DDP多藥耐藥逆轉作用的研究[J].天津中醫藥,2010,27(4): 334-336.

[3]李儀奎.中藥藥物實驗方法學[M].上海:上海科學技術出版社,1991:36.

[4]徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京:人民衛生出版社,2005:1757-1766.

[5]Kerr JF,Winterford CM,Harmon BV.Apop tosis.Its significance in cancer and cancer therapy[J].Cancer,1994,73 (8):2013-2026.

[6]Costantini P,Jaeotot E,Deeaudin D.Mitochondrion as a novel targetofanticancer chemotherapy[J].JNatl Cancer Institute,2000,92(13):1042-1053.

[7]賈英杰,史福敏,賈彥燾,等.消巖湯劑治療晚期非小細胞肺癌臨床研究[J].天津中醫藥,2004,21(2):108-110.

[8]賈英杰,張瑩,孫一予,等.消巖湯不同時段參與化療治療非小細胞肺癌臨床療效觀察[J].天津中醫藥大學學報,2006,25(3):164-165.

[9]陳旭昕,張艱,趙峰,等.姜黃素對人肺腺癌A 549/DDP細胞增殖活性的影響[J].第四軍醫大學學報,2007,28 (24):2287-2290.

[10]史曦凱,張翼軍,趙春景.人參皂苷單體 Rb1對多藥耐藥細胞系K562/HHT的耐藥逆轉作用[J].第三軍醫大學學報,1999,21(11):825-826.